鐵氰化鉀法測(cè)定藥用麥芽糊精中還原糖含量

陳 皓 ，周 冰 ，黃桂琴

（1.重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司，重慶 400065； 2.重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331）

在食品行業(yè)中，麥芽糊精可用作糖果、果汁、糕點(diǎn)中的功能性原料和調(diào)節(jié)劑[1]。其溶液能在胃腸道快速釋放葡萄糖的同時(shí)又不含果糖、半乳糖、乳糖和蔗糖等，特別適用于那些消化道糖不耐受疾病患者[2]。在制藥工業(yè)中，麥芽糊精可用作藥物輔料，如口服固體制劑的填充劑、液體制劑增稠劑和藥物助分散劑等，可將其作為片劑的直壓型輔料[3]、口腔膜劑的填充劑[4]和擠壓成型速釋片的基質(zhì)材料[5]等，近年來(lái)也廣泛應(yīng)用于納米藥物包封、3D打印藥物[6]等一些新興制藥領(lǐng)域。從馬鈴薯、玉米、大米等農(nóng)作物中提取出淀粉，經(jīng)適當(dāng)工藝水解可制得麥芽糊精，其主要成分是系列鏈長(zhǎng)分布范圍較寬的糖類化合物，包括多聚糖、低聚糖、寡糖等[7]。還原糖含量也稱為葡萄糖當(dāng)量（DE），可作為劃分不同規(guī)格產(chǎn)品的依據(jù)。《美國(guó)藥典》（United States Pharmacopoeia）收載有麥芽糊精標(biāo)準(zhǔn)[8]，采用斐林試劑法檢測(cè)還原糖含量。該方法操作和計(jì)算不復(fù)雜，但影響試驗(yàn)結(jié)果的因素較多，如還原糖實(shí)際含量、溶液濃度、加熱效率、共沸時(shí)間、滴定速度、終點(diǎn)觀察等[9]。本研究中建立了利用鐵氰化鉀等試劑與麥芽糊精中的還原糖反應(yīng)后，用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，為藥用麥芽糊精的還原糖含量檢測(cè)提供了新思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XS105Du型電子天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易＜上海＞有限公司）；Agilent Cary 8454型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（安捷倫科技有限公司）；HH-S26S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）。

1.2 試藥

鐵氰化鉀（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)為2017110801）；六水合三氯化鐵（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20180110）；無(wú)水草酸（成都化夏化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為2017011702）；碳酸鈉（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)為20160218）；D-無(wú)水葡萄糖（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)為SLBP5997V）；五水硫酸銅（廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)為20171024）；酒石酸鉀鈉（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)為2018040201）；氫氧化鈉（重慶川東化工集團(tuán)有限公司，批號(hào)為20180301）；次甲基藍(lán)（三水，上海三愛(ài)思試劑有限公司，批號(hào)為20180202）；藥用麥芽糊精（山東西王集團(tuán)有限公司，批號(hào)為1805013）。

2 方法與結(jié)果

2.1 美國(guó)藥典方法

根據(jù)《美國(guó)藥典》（USP41）方法，取葡萄糖制備成質(zhì)量濃度為10 g／L的對(duì)照品溶液。取麥芽糊精5 g，制得質(zhì)量濃度為50 g／L的供試品溶液。

取堿性酒石酸銅試液25 mL，置錐形瓶中，平行取2份。其中1份在2 min內(nèi)加熱至沸騰，并用對(duì)照品溶液滴定到近終點(diǎn)（比預(yù)期終點(diǎn)少0.5 mL），保持微沸，加亞甲藍(lán)溶液（1%，g／mL）2滴，在1 min內(nèi)用對(duì)照品溶液完成滴定（藍(lán)色消失）；再將另1份加熱至沸，用供試品溶液作滴定液，同法滴定，計(jì)算得還原糖含量為5.80%（以葡萄糖計(jì)）。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，多個(gè)方法參數(shù)，如加熱溫度、沸騰狀態(tài)、指示劑加入時(shí)機(jī)等均不易精確控制，且還直接影響試驗(yàn)結(jié)果。

擇期，更換試驗(yàn)員，同法測(cè)定同一批供試品，計(jì)算得還原糖含量為6.62%（以葡萄糖計(jì)）。2次結(jié)果相對(duì)極差為13.2%。斐林試劑法可能存在結(jié)果不易重現(xiàn)的問(wèn)題。

在制藥行業(yè)中，分析方法在其整個(gè)生命周期里往往面臨在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室間轉(zhuǎn)移的需求，因此需要方法的影響因素易控，結(jié)果易重現(xiàn)。當(dāng)需要測(cè)定藥用麥芽糊精時(shí)，斐林試劑法不作首選。

2.2 鐵氰化鉀法

2.2.1 原理

鐵氰化鉀法又稱為Park-Johnsonferricyanide submicromethod[10]。鐵氰化鉀是一種具有氧化性的絡(luò)合物，在一定條件下，麥芽糊精中還原糖與鐵氰化鉀發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成無(wú)色的亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀可繼續(xù)與三氯化鐵發(fā)生顯色反應(yīng)，定量生成普魯士藍(lán)，此化合物在草酸溶液中具有一定的穩(wěn)定性[11]，有明顯的可見(jiàn)光吸收。化學(xué)反應(yīng)式步驟如下。

2.2.2 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：精密量取葡萄糖貯備液（質(zhì)量濃度為 1 g ／L）0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分別置 100 mL 容量瓶中，加水定容。精密量取各5 mL，分別置5支試管中，均加入碳酸鈉溶液2 mL和鐵氰化鉀試液2 mL，置70℃水浴中加熱30min，取出，迅速用流水冷卻至室溫，用草酸溶液將pH調(diào)至3.6，加入三氯化鐵溶液5 mL，靜置5 min使顯藍(lán)色，再分別移至50 mL容量瓶中，用水定容。

供試品溶液：稱取樣品粉末60 mg，置100 mL容量瓶中，加水定容，精密量取2.0 mL，置試管中，精密加水3 mL、碳酸鈉溶液2 mL和鐵氰化鉀試液2 mL，置70℃水浴中加熱30min，取出，迅速用流水冷卻至室溫，用草酸溶液將pH調(diào)至3.6，加入三氯化鐵溶液5 mL，靜置5 min使顯藍(lán)色，再分別移至50 mL容量瓶中，加水定容。

2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

取葡萄糖貯備液，用水稀釋成20 μg／mL，精密量取5 mL，置試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液項(xiàng)下方法顯色后，在600～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果在700～720nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收波段較強(qiáng)，最終選擇710 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 紫外吸收光譜圖

2.2.4 鐵氰化鉀用量選擇

取葡萄糖貯備液，用水稀釋成2 μg／mL，精密量取5 mL，置試管中，平行5份，各加碳酸鈉溶液2 mL、鐵氰化鉀試液0.5～2.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液項(xiàng)下方法顯色后，在 710 nm 波長(zhǎng)處顯色。鐵氰化鉀用量為 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 時(shí)，吸光度分別為 0.592 4，0.632 5，0.635 0，0.643 4，0.641 5。結(jié)果表明，鐵氰化鉀試液的加入量在1.0～2.5 mL范圍內(nèi)，吸光度穩(wěn)定。

2.2.5 溫度、時(shí)間考察

鐵氰化鉀與還原糖的反應(yīng)需要堿性環(huán)境和較高的溫度條件，加熱時(shí)間對(duì)結(jié)果也有明顯影響。經(jīng)多次試驗(yàn)，當(dāng)水浴溫度為65～100℃、水浴時(shí)間不低于25 min時(shí)，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.3 樣品含量測(cè)定

取麥芽糊精樣品，按鐵氰化鉀法供試品溶液項(xiàng)下方法顯色后，于710 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算其中的還原糖含量。平行測(cè)定6份，還原糖以葡萄糖計(jì)。詳見(jiàn)表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝6）

2.4 鐵氰化鉀法驗(yàn)證

重復(fù)性試驗(yàn)：由不同試驗(yàn)人員，在不同日期，按鐵氰化鉀法分別測(cè)定還原糖含量，結(jié)果分別為6.13%和6.04%，考察2 d結(jié)果的相對(duì)極差為1.50%。

線性關(guān)系考察：以顯色反應(yīng)的相應(yīng)試劑為空白溶液。取已顯色的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，于710nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度（C，μg／mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A＝0.286C＋0.032 3，r＝0.999 7（n＝5）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在 0.50 ～ 4.00 μg／mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

定量限確定：取空白溶液，于710 nm波長(zhǎng)處測(cè)定20次吸光度，并統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ），再結(jié)合回歸方程的斜率（S）計(jì)算。定量限 ＝（10× σ）／S＝（10×0.003 7）／0.286 ＝ 0.13 μg ／mL。

準(zhǔn)確度試驗(yàn)：取已知還原糖含量（以葡萄糖計(jì)）為6.1%的麥芽糊精樣品約60 mg，用水溶解后取溶液適量（相當(dāng)于麥芽糊精 1.2 mg，還原糖 73.2 μg），平行 9份，按已知還原糖含量的80%，100%，120%加入葡萄糖對(duì)照品，每個(gè)比例3份，稀釋至線性范圍內(nèi)，依法測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

3 討論

還原糖含量是麥芽糊精等多糖類化合物的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)。前人總結(jié)了常見(jiàn)的還原糖測(cè)定方法，大致可分為堿性酒石酸銅（斐林試劑）法、堿性銅溶液法、堿性汞溶液法、堿性鐵氰化物法、低碘酸鹽法、亞硒酸法等[12]。美國(guó)藥典采用斐林試劑法測(cè)定麥芽糊精還原糖，但存在一些不足，有改進(jìn)必要。

本研究中建立了一種基于堿性鐵氰化物還原的分光光度法測(cè)定麥芽糊精的還原糖含量，其線性范圍為0.50～4.00μg／mL，相關(guān)系數(shù)大于0.999，RSD小于5%，回收率為89.69% ～100.21% 。不同人員的測(cè)定結(jié)果較斐林試劑法易于重現(xiàn)。本方法中，在0.18～1.18 AU范圍內(nèi)，還原糖濃度與有色產(chǎn)物吸光度線性關(guān)系良好。但麥芽糊精有多種規(guī)格，其還原糖含量分布范圍較寬，還原糖含量為5%～20%。為了避免高含量規(guī)格糊精制備的供試品溶液濃度超出線性范圍，可參考美國(guó)藥典的方法，先進(jìn)行1次預(yù)試驗(yàn)，估算待測(cè)糊精的還原糖大致濃度范圍，再設(shè)計(jì)合理的稀釋倍數(shù)，使溶液終濃度落在本方法的線性范圍內(nèi)，以便獲得滿意的測(cè)定結(jié)果。

文獻(xiàn)[13]報(bào)道，普魯士藍(lán)由亞鐵氰化鉀和氯化鐵反應(yīng)制得，不同比例的反應(yīng)物所得的產(chǎn)品不同。當(dāng)反應(yīng)物之比為1∶1時(shí)，產(chǎn)物是亞鐵氰化鐵鉀，為可溶性普魯士藍(lán)；當(dāng)反應(yīng)物之比為3∶4時(shí)，產(chǎn)物是亞鐵氰化鐵，為不溶性普魯士藍(lán)。氯化鐵用量遠(yuǎn)大于第1步反應(yīng)中產(chǎn)生的亞鐵氰化鉀的量，推測(cè)終產(chǎn)物中有亞鐵氰化鐵出現(xiàn)。為此，加入草酸提高了不溶性普魯士藍(lán)的可溶性。

新建的鐵氰化鉀法測(cè)定麥芽糊精還原糖的靈敏度好，操作簡(jiǎn)便，參數(shù)易控，結(jié)果穩(wěn)定。在麥芽糊精及其他多糖化合物的還原糖含量測(cè)定中具有廣闊的應(yīng)用前景。