系統性紅斑狼瘡患者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7和miR-21的表達及意義

聶 萃 劉莉莎 周 燕

(重慶市第四人民醫院檢驗科，重慶400014)

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是免疫調節發生紊亂的自身免疫性疾病，并以產生自身抗體及免疫復合物為主要特征[1]。目前SLE發病機制尚未完全闡明，以往研究認為，患者免疫系統中自身抗原失去耐受主要是T細胞與CD4+輔助T淋巴細胞等免疫活性細胞的異常活化導致，使機體免疫紊亂從而啟動或持續自身免疫性疾病[2]。相關研究表明組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)在細胞異常狀態下活性增強并破壞乙酰化與去乙酰化的平衡狀態，并可參與機體免疫反應調節過程[3]。隨著對SLE發病機制的深入研究，發現微小RNAs(micro RNAs，miRNAs)作為一類內源性非編碼小RNA分子可在多種生物學過程中發揮重要作用，研究報道指出miR-21可通過調控靶基因表達進而參與固有免疫及適應性免疫應答的調節過程，并可在多種自身免疫性疾病中異常表達[4]。但關于HDACs、miR-21與SLE間的關系尚未見報道，因此本研究主要分析SLE患者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7和miR-21的表達水平及臨床意義，為進一步揭示SLE發病機制提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年10月至2017年5月間我院收治的85例SLE患者為SLE組，且均符合1997年美國風濕協會修訂的相關診斷標準[5]，其中男22例，女63例，年齡為16～40歲，平均(25.32±9.37)歲。計算SLE活動指數(SLE disease activity index，SLEDAI)并對SLE組患者進行活動性評估，將SLEDAI評分>10作為活動組(52例)，SLEDAI評分≤10作為穩定組(33例)[6]。另選取同期于我院進行體檢的37例健康志愿者為對照組，其中男13例，女24例，年齡為年齡為20～36歲，平均(26.24±7.34)歲。兩組臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準:①近期未服用相關治療藥物；②未患有其他自身免疫性疾病者；③臨床資料完整者；④患者與健康志愿者知情且均簽署知情同意書。排除標準:①患有嚴重糖尿病疾病；②合并其他惡性腫瘤患者；③心腦血管疾病患者；④妊娠期婦女；⑤精神疾病者。PBS緩沖液購自Hyclone公司，RLT Buffer 裂解液購自上海易利生物科技有限公司， 總RNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司，反轉錄試劑盒購自美國Promega公司，HDAC2、HDAC7等引物均由生工生物(上海)工程有限公司合成；熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司，Olympus BX2 生物熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1制備單核細胞與CD4+T細胞 抽取兩組研究對象外周血10 ml并采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，將PBMC細胞懸液加入PBS洗滌并進行離心，10 min后棄上清并按照約107個細胞加入80 μl緩沖液及20 μl MACS CD4磁珠的比例混勻，將其置于4℃孵育15 min并按照每107個細胞加入1～2 ml 緩沖液洗滌細胞，離心10 min后棄上清并加入500 μl緩沖液洗滌細胞。之后置LS分離柱于Midi MACS分選器中并用3 ml緩沖液濕潤LS分離柱，將細胞懸液加入分離柱中并在運作期間采用3 ml緩沖液濕潤LS分離柱3次，30 min后將LS分離柱移出磁場并加入5 ml緩沖液將滯留于LS分離柱中的CD4+T細胞沖出，并將其置于-80℃凍存。

1.2.2qRT-PCR法檢測CD4+T細胞HDAC2、HDAC7與miR-21的表達水平 取出凍存的CD4+T細胞沉淀，解凍后加入RLT裂解液裂解細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書操作將RNA反轉錄為cDNA， 將CD4+T細胞cDNA稀釋5倍為模板進行qRT-PCR檢測。反應體系為20 μl:SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 10.0 μl，上下游引物各1.0 μl，cDNA模板4.0 μl，ddH2O 4 μl。miR-21以U6為內參基因，HDAC2、HDAC7均以β-actin為內參基因，引物序列見表1。反應程序為:95℃ 15 min；94℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃30 s，共40個循環。反應結束后收集數據，并對所得數據Ct值進行分析，采用2-ΔΔCt算法計算HDAC2、HDAC7與miR-21的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

Tab.1 qRT-PCR primer sequences

GeneForward primer 5′-3′Reverse primer 5′-3′HDAC2AGTCAAGGAGGCGGCAAAATGCGGATTCTATGAGGCTTCAHDAC7CTTCTCCACAAGGACAAGCTCCAGGGTTCTGTAGGβ-actinTGCTGTCCCTGTATGCCTCTTGATGTCACGCACGATTTmiR-21GTGCAGGGTCCGAGGTGCCGCTAGCTTATCAGACTGATGTU6ATTGGAACGATACAGAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG

1.2.3免疫學指標檢測 SLE患者于入院后與健康志愿者體檢時各抽取清晨空腹靜脈血3 ml，并將其分別置于EDTA-K2抗凝管內，離心后吸取上層血清進行相關免疫指標檢查。主要包括免疫球蛋白IgA、IgG與IgM以及補體C3與C4，采用免疫比濁法檢測免疫指標并在熒光顯微鏡下觀察[7]。

2 結果

2.1一般資料比較 兩組免疫學指標存在明顯差異，SLE組患者IgA、IgM、IgG水平均高于對照組，而C3、C4均低于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)，兩組在年齡、性別等方面差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見表2。

2.2SLE患者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7與miR-21表達水平的檢測結果 SLE患者活動組HDAC2、HDAC7表達水平均顯著低于對照組與穩定組(P<0.05)，而穩定組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)；SLE患者活動組miR-21表達水平顯著高于對照組與穩定組(P<0.05)，且穩定組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表3。

ProjectControl group(n=37)SLE group(n=85)χ2/tPAge26.24±7.3425.32±9.370.5300.597Gender(Male/Female)13/2422/631.0790.299IgA(mg/L)1.12±0.562.03±0.697.0680.000IgM(mg/L)1.09±0.522.84±1.238.3210.000IgG(mg/L)12.32±3.6124.21±4.2314.8910.000C3(mg/L)0.97±0.640.45±0.236.6020.000C4(mg/L)0.51±0.310.15±0.0210.7130.000

2.3HDAC2、HDAC7、miR-21表達水平與SLE患者免疫學指標的相關性 將SLE患者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7、miR-21表達水平與患者免疫學指標進行相關性分析，結果顯示HDAC2、HDAC7均與miR-21、IgA、IgM、IgG呈負相關，而均與C3、C4呈正相關；miR-21與IgA、IgM、IgG呈正相關，而與C3、C4呈負相關；IgA、IgM、IgG均與C3、C4呈負相關，差異均具有統計學意義(P<0.05)，詳見表4。

2.4ROC分析HDAC2、HDAC7與miR-21對SLE的診斷價值 結果顯示HDAC2的敏感度為92.94%，特異度為64.86%，截斷值為0.66；HDAC7的敏感度為92.94%， 特異度為67.57%， 截斷值為0.95；miR-21的敏感度為74.12%，特異度為75.68%，截斷值為1.06，詳見圖1、表5。

GroupsnHDAC2HDAC7miR-21Control group370.89±0.151.18±0.231.00±0.12SLE group850.52±0.050.69±0.121.17±0.18Activity group520.55±0.081)2)0.58±0.111)2)1.22±0.211)2)Stable group330.88±0.241.08±0.201.05±0.26

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the stable group,2)P<0.05.

圖1 HDAC2、HDAC7與miR-21對SLE的ROC分析Fig.1 ROC analysis of HLE2,HDAC7 and miR-21 for SLE

表4 HDAC2、HDAC7和miR-21表達水平與SLE患者免疫學指標的相關性(r/p)

Tab.4 Correlation of HDAC2,HDAC7 and miR-21 mRNA expression with immunological parameters of patients with SLE(r/p)

IndexHDAC2HDAC7miR-21IgAIgMIgGC3HDAC70.519/0.000miR-21-0.321/0.003-0.493/0.000IgA-0.325/0.002-0.724/0.0000.472/0.000IgM-0.484/0.000-0.766/0.0000.523/0.0000.849/0.000IgG-0.450/0.000-0.629/0.0000.447/0.0000.609/0.0000.711/0.000C30.291/0.0070.606/0.000-0.407/0.000-0.737/0.000-0.702/0.000-0.701/0.000C40.346/0.0010.498/0.000-0.347/0.001-0.536/0.000-0.602/0.000-0.432/0.0000.462/0.000

表5 HDAC2、HDAC7與miR-21對SLE的ROC分析

Tab.5 ROC analysis of HLE2,HDAC7 and miR-21 for SLE

Detection IndicatorAUCStandard errorZ statistics95% confidence intervalPHDAC20.8480.0408.6390.772-0.906<0.000HDAC70.7950.0525.6630.712-0.863<0.000miR-210.7740.0456.1510.690-0.845<0.000

表6 影響SLE相關因素的Logistic分析

Tab.6 Logistic analysis of factors affecting SLE

Influencing factorβSEWaldPOR95%CIIgA0.4840.3581.8260.0341.6221.225-2.148IgM0.4410.3361.7230.0411.5541.137-2.125HDAC21.0500.4236.1650.0012.8582.032-4.021HDAC70.7450.3275.1950.0112.1071.687-2.632miR-210.7230.4083.1420.0232.0611.564-2.716

2.5SLE影響因素的Logistic分析 將影響SLE發生的相關因素進行Logistic分析，結果顯示HDAC2、HDAC7、miR-21、IgA及IgM水平異常均為SLE發生的危險因素，詳見表6。

3 討論

SLE是一類由多因素引起機體免疫異常的自身免疫性疾病，同時可激活局部補體系統并導致局部組織的炎癥損傷[8]。其主要表現為大量自身抗體產生與免疫復合物的沉積，并可損傷腎臟、心臟等組織器官[9]。目前關于SLE發病機制尚未完全清楚，因而需尋找新方向進一步探究其發病因素以控制病情發展。研究表明CD4+T細胞與B細胞相互作用可促進體液免疫亢進并產生自身抗體進而參與SLE疾病發生過程[10]。隨著生物技術進步，研究發現HDACs可通過調節組蛋白與胞內蛋白的乙酰化水平并改變細胞表型進而參與機體免疫細胞分化及免疫反應過程[11]。相關研究報道指出miR-21可通過調控T細胞中轉錄因子Foxp3進而參與調節性T細胞分化及發育并可影響獲得性免疫細胞的功能[12]。CD4+T細胞HDACs與miR-21在SLE發生過程中是否發揮相似功能尚不明確。因此，本研究旨在探討SLE患者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7與miR-21的表達特點及其與患者臨床免疫學指標的相關性。

HDACs可分為4大類與18個亞型，HDAC2屬于HDACⅠ類亞型，研究表明HDACⅠ可通過降低腎臟血管系膜細胞炎癥介質生成從而改善腎臟功能最終緩解狼瘡腎炎[13]。研究發現有害顆粒的應激作用可降低HDAC2活性，HDAC2可產生白細胞介素-8、腫瘤壞死因子-α且均為炎性反應的代表性標志物，同時可調節機體的免疫反應[14]。HDACⅡ型蛋白酶分子位于細胞質并可在細胞質與細胞核間出入，HDAC7屬于HDACⅡ亞型且在癌細胞中高表達，相關研究表明HDAC7在急性淋巴細胞白血病患者骨髓中表達水平與疾病發生有關，且HDAC7表達水平越低疾病進展越快[15]。研究表明HDAC7可影響p21等細胞凋亡蛋白表達，而凋亡細胞與自身免疫性疾病的發生密切相關[16，17]。關于HDAC2、HDAC7在SLE發病過程中的相關研究較少，因此本研究通過qRT-PCR法檢測SLE患者與健康志愿者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7表達水平，結果顯示SLE組HDAC2、HDAC7表達水平均顯著低于對照組，其中SLE活動組中兩者表達水平顯著低于穩定組與對照組，說明SLE患者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7表達水平顯著降低，且其表達水平降低程度與疾病進展密切相關。分析其原因可能為SLE患者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7表達降低誘導T細胞凋亡并通過凋亡途徑進而導致抗原提呈細胞提呈至反應性T細胞引起自身反應，最終導致SLE的發生。本研究結果檢測并觀察SLE患者免疫指標表達，結果顯示IgA、IgM、IgG水平顯著升高，而C3、C4顯著降低，進一步分析發現HDAC2、HDAC7均與miR-21、IgA、IgM、IgG呈顯著負相關，而均與C3、C4呈顯著正相關，且研究報道指出IgA、IgM等免疫學指標用于鑒別SLE并可反映疾病嚴重程度[18]。提示SLE發病時外周血CD4+T細胞等發生作用活化T細胞并釋放大量細胞因子而降低HDAC2、HDAC7表達水平進而促進疾病進展。本研究采用ROC法分析HDAC2、HDAC7對SLE的臨床診斷價值，結果顯示HDAC2與HDAC7均具有較高的靈敏度與特異度，推測HDAC2與HDAC7可作為臨床早期診斷SLE的重要指標。

miR-21位于人類17q23.2染色體，研究表明miR-21可調控程序性死亡分子4、轉錄信號轉導子和激活子3等轉錄因子、細胞因子表達進而參與機體免疫細胞的凋亡、分化及生成等過程[19]。miR-21在銀屑病病灶的上皮細胞中表達水平顯著升高，將其轉染CD4+T細胞后導致CD4+T細胞凋亡并參與銀屑病發生過程[20]。相關研究表明潰瘍性結腸炎患者體內miR-21表達水平顯著升高，miR-21可能通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)途徑影響T細胞的分化及功能進而參與腸內炎癥及免疫應答過程[21]。與此相似，本研究結果顯示SLE活動組miR-21表達水平顯著高于對照組與穩定組，且穩定組與對照組差異無統計學意義，說明SLE患者miR-21呈高表達且參與疾病發生過程。本研究將miR-21表達水平與患者免疫血清指標進行相關性分析，結果顯示miR-21與IgA、IgM、IgG呈顯著正相關，而均與C3、C4呈顯著負相關，提示miR-21表達水平升高導致機體免疫耐受功能下降并產生大量自身抗體進而加快SLE進展。ROC分析結果顯示miR-21的敏感度為74.12%，特異度為75.68%，截斷值為1.06，說明檢測SLE患者miR-21表達水平高于1.06時可判斷疾病是否已發生。同時本研究發現HDAC2、HDAC7均與miR-21呈顯著負相關，且Logistic回歸分析顯示HDAC2、HDAC7、miR-21、IgA及IgM水平異常均為SLE發生的危險因素。本研究結果揭示SLE患者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7及miR-21表達水平異常與疾病活動程度有關，且均可導致疾病的惡性發展。

綜上所述，SLE患者CD4+T細胞HDAC2、HDAC7表達水平顯著降低，而miR-21表達水平顯著升高，HDAC2、HDAC7均與miR-21呈負相關且均可參與SLE發生及進展過程，檢測CD4+T細胞HDAC2、HDAC7及miR-21表達水平有助于臨床早期診斷SLE及評估病情進展。本研究存在不足之處，關于HDAC2、HDAC7與miR-21在SLE發病過程中的具體作用機制有待進一步研究。