基于高通量測序分析老面中菌群多樣性及其對饅頭品質的影響

高 靜 劉 敏 吳丹丹 周中凱

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

老面作為傳統發酵劑，發酵歷史悠久，主要以野生酵母、乳酸菌等多種細菌為發酵菌種，再加入面粉和成面團，過夜發酵，次日在面團中添加面粉和適量堿，和面后成型醒發蒸制，即得老面饅頭[1-2]。干酵母為純種發酵，雖然發酵速度快，但存在風味單一、營養價值不高等缺點。而傳統發酵劑老面經過多種微生物糖化和酯化的協同作用，可生成醇、烴、酯、醛、酮、酯、芳香物質等多種風味物質，使饅頭營養價值更高[3]。同時，在老面發酵期間有些菌產生淀粉酶以及蛋白酶等酶類，對面團流變性有很好的改善作用，使饅頭組織結構柔軟細膩，富有韌性，老化速率減緩，貨架期延長[4]。老面發酵使面團更有彈性，更加松軟，從而改善饅頭的比容和質構。因此，研究老面中的菌群多樣性具有十分重要的意義。

基因可作為揭示生物物種的特征核酸序列，是最適于細菌系統發育和分類鑒定的指標。16S rDNA擴增子測序技術已成為研究環境樣本中微生物群落組成結構的重要手段[5-7]。利用Hiseq平臺對ITS1或ITS2區進行測序，具有測序深度高、利于鑒定低豐度群落物種以及費用低的特點，也成為研究真菌群落多樣性的首選之策[8-9]。

本研究以4種不同地區的老面為主要研究對象，利用高通量測序技術，對老面菌群16sV4區(細菌)和ITS1區(真菌)進行擴增，HiSeq測序平臺測定其基因序列，在與SILVA的SSUrRNA數據庫(細菌)和Unit數據庫(真菌)中的基因序列進行比對，即可得到老面中微生物種類及豐度；并分析比較純酵母發酵和老面發酵對饅頭比容和質構的影響。有利于了解傳統發酵劑老面中復雜的菌群結構及微生物對面團及饅頭品質的影響，同時為面食的工業化生產提供重要的數據參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥粉：金沙河家用小麥粉(中筋粉)；干酵母：安琪高活性干酵母(Y)；老面：來自河北邢臺(HB)、山西運城(SX)、山東曹縣(SD)、云南麗江(YN)。

漢尚HM740和面機；LHP-160恒溫恒濕培養箱；BVM6630面包體積測定儀；TA.XT.Plus質構儀。

1.2 方法

1.2.1 測序過程

測序過程：老面樣品準備→基因組DNA的提取和PCR擴增→PCR產物的混樣和純化→文庫構建→Hiseq上機測序

1.2.2 生物學信息分析

PCR產物采用Illumina HiSeq高通量測序平臺進行高通量測序。對高質量序列提取后進行生物學信息分析，包括：OTUs聚類分析、菌群多樣性(Chao1、Shannon指數)分析、稀釋性曲線分析、菌群群落種類和豐度分析；可全面了解老面中菌群結構組成。

1.2.3 老面饅頭品質分析

老面饅頭的制作工藝參數由前期的單因素和正交實驗確定，干酵母饅頭的制作根據說明書進行饅頭蒸制。饅頭的制作工藝流程：老面、小麥粉、水→和面→發酵→分割、整形→二次醒發→蒸制。

饅頭冷卻一定時間后，將其平整地放在體積儀樣品測定區進行測定，并記錄比容值；從冷卻好的饅頭中間部分切出表面平整的尺寸2 cm×2 cm×2 cm的樣品，置于P/36 R探頭下進行質構測定。每種樣品至少測定3次，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 老面中微生物測序數據結果

數據處理過程中各步驟得到的統計結果見表1和表2。細菌測序獲得的Tags序列有效率除HB樣品為88.01%，其他樣品都達到了92%以上；真菌測序獲得的測序Tags序列有效率達97%以上，測序結果較為理想。

表1 高通量測序序列基本信息(細菌)

表2 高通量測序序列基本信息(真菌)

2.2 OTUs統計及多樣性分析

對4種老面樣品在97%一致性閾值下的菌群多樣性進行統計，如表3。Chao1指數的大小可表示菌群豐度，值越大，菌群豐度越大；Shannon 指數的大小可表示菌群多樣性，值越大，菌落多樣性越高[10-11]。從表3可看出：4個老面樣品經鑒定共獲得667個細菌OTU和331個真菌OTU；HB樣品的Chao1指數和Shannon指數最高，其次是YN，SD和SX相近且最低；說明HB樣品中的物種復雜度最大，細菌菌群多樣性最豐富，其次是YN樣品，而SD和SX樣品的物種豐富度和群落多樣性均為最低。SX樣品的Chao1指數和Shannon指數等都明顯低于其他3個樣品，說明SX樣品的物種豐富度和群落多樣性最低；SD和YN老面樣品的真菌菌群豐度和菌群多樣性較高。

表3 樣品中OTUs和多樣性比較

由圖1a可看出，SX和SD樣品的曲線幾乎重合且趨于平緩，說明SX和SD樣品的豐富度相近且測序數據量已接近合理，測序深度已基本覆蓋樣品中所有細菌，也間接說明這2個樣品中的菌群復雜程度相對簡單；而HB的稀釋曲線最高，且HB和YN樣品的稀釋曲線高于其他2個樣品(SX和SD)，說明HB和YN樣品比SX和SD樣品中的物種復雜度高。由圖1b可看出，SX樣品的曲線最低且最平緩，說明SX樣品的真菌復雜度最低且測序數據量合理；而其他3個樣品中SD樣品的菌群復雜度最高，且顯著高于SX樣品，其稀釋曲線結果與OTUs統計結果相吻合。

圖1 稀釋曲線

2.3 物種注釋

根據物種注釋結果，選取每個樣本在門(Phylum)和屬(Genus)水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱狀堆積圖。

由圖2可知，這4種不同地區老面樣品中優勢真菌菌門主要是擔子菌門(Basidiomycota)，在HB、SX、SD和YN樣品中所占比例分別為99.32%、99.81%、98.94%和99.26%。而優勢細菌菌門主要是厚壁菌門(Firmicutes)和生氧光細菌門(Oxyphotobacteria)。厚壁菌門在HB、SX、SD和YN樣品中所占比例分別為52.466%、61.515%、53.931%和62.555%。生氧光細菌門在HB、SX、SD和YN樣品中所占比例分別為41.004%、35.540%、42.877%和34.892%。另外，這4種老面樣品中擬桿菌門(Bacteroidetes)存在顯著差異；HB樣品中擬桿菌門所占比例為3.740%，其他樣品(SX、SD和YN)所占比例依次為0.053%、0.069%和0.145%。數據表明，4個老面樣品的菌群結構在門水平存在差異。

圖2 門水平上的物種相對豐度柱形圖

由于樣品性質和數據庫的限制，真菌注釋不到屬水平，所以未列出真菌在屬水平的相對豐度圖。由圖3可知，從細菌的屬水平看，這4種老面樣品中菌群組成存在差異；其中，YN樣品與其他3個樣品存在顯著性差異。除了未確定的-生氧光細菌門(unidentified-oxyphotobacteria)，HB、SX和SD樣品中以片球菌屬(Pediococcus)為主，所占比例為43.166%、57.278%和50.320%，而YN樣品僅為4.227%；YN樣品中以乳桿菌屬(Lactobacillus)為主，占比為53.573%，其他3種樣品占比分別為5.376%、3.715%和3.232%；此外，還有一定量的明串珠菌和魏斯氏菌等。來自于北方的2個老面樣品(SX和SD)菌群結構在屬水平上較為相似，與來自于南方的老面樣品(YN)存在顯著差異，具有明顯的地區特色。

圖3 屬水平上的物種相對豐度柱形圖(細菌)

自然發酵面團中普遍含有的菌群主要是片球菌屬或乳桿菌屬，可能在面團發酵中發揮著重要的作用。張國華等[12]通過對老面的菌群結構研究發現，乳桿菌屬在自然發酵面團中最普遍；片球菌常存在于植物性發酵食品中，在發酵面團中也常被發現。Vuyst等[13]發現酵頭中乳酸菌包括魏斯氏菌屬(Weissella)、片球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌屬(Leucouostoc)和乳球菌屬(Lactobacillus)等。Corsetti等[14]發現傳統酵頭中最常見的乳酸菌類群是乳桿菌屬，主要包括 Lb.sanfranciscensis、Lb.rossiae、Lb.paralimeutarius、植物乳桿菌(Lb.plautarum)和短小乳桿菌(Lb.brevis)等。乳桿菌屬是饅頭傳統發酵劑中的優勢菌群，對饅頭質構具有一定的改善作用。郁書懷[15]研究表明片球菌屬中的乳酸片球菌和戊糖片球菌能夠發酵產生一種天然防腐劑PLA，具有廣闊的發展前景。

2.4 物種豐度聚類熱圖

根據菌群OTUs聚類分析，選取出豐度較大菌屬，從物種層面上進行聚類，繪制成熱圖，可看出哪些物種在樣本中聚集較多或含量較低。結果如圖4。

由圖4可以看出，不同地區老面豐度較大細菌(屬)和真菌(屬)的種類差別較大，形成特定的菌群結構。HB老面樣品中豐度較大的細菌菌群數量明顯多于其他3個老面樣品，說明HB樣品細菌菌群豐富度較高；SD老面樣品中豐度較大的真菌菌群數量略多于YN樣品，明顯多于其他2個老面樣品，說明SD樣品真菌菌群豐富度較高，且這4種老面在菌屬分布上存在顯著差異。

圖4 各樣品在屬水平菌落相對豐度

在蒸制饅頭的過程中發現，HB樣品的發酵力明顯優于其他3個樣品，這可能與其含有的豐富的菌群有關。另外，HB樣品中的鏈霉菌屬(Streptomyces)微生物可產生豐富的次生代謝產物，且具有良好的生物活性[16]?？祭瓧U菌屬(Phascolarctobacterium)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum)和棲糞桿菌屬(Faecalibacterium)具有短鏈脂肪酸產生的功能[17]。而真菌菌屬主要有毛殼屬(Chaetomium)和散尾鬼筆屬(Lysurus)。

SX樣品中豐度較大的細菌菌屬主要有片球菌屬(Pediococcus)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)和醋桿菌屬(Acetobacter)；真菌菌屬主要有Lactifluus和Wickerhamomyces。SD樣品中豐度較大的真菌菌屬主要有Arthrocladium、Knufia、Graphium、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)等。

YN樣品中含有豐富的乳球菌屬、乳桿菌屬等，張宜鳳等[18]在云南的傳統乳制品中就發現了豐富的腸球菌屬、乳球菌屬和乳桿菌屬，是貢獻風味的主要菌群。另外，YN樣品中還含有豐富的真菌菌屬，鑒定出曲霉屬(Aspergillus)和根霉屬(Rhizopus)。

2.5 PCA分析

基于OTU水平的PCA分析結果展示如圖5。由圖5可知，SX樣品與SD樣品距離最接近，說明這2種樣品的細菌菌群組成最相似；SX樣品和SD樣品與其他2個樣品距離較遠，說明與其他2個樣品細菌菌群組成差異較大。而真菌菌落PCA分析結果顯示SX和HB樣品的距離最近，與其他2個樣品距離較遠，說明SX和HB這2種樣品的真菌菌群組成最相似，與其他2個樣品的真菌菌群組成差異較大。綜上，YN樣品與其他3個樣品的菌群組成差異最大。

圖5 各樣品菌群結構的PCA分析

表4 饅頭的質構參數

注：表中數據為平均值±標準差； 同列不同小寫字母表示4種老面饅頭的質構參數在0.05水平存在顯著差異(n≥3)。

2.6 饅頭的品質分析

由圖6可知，5種饅頭的比容從大到小依次為HB>SD>YN>SX>Y，4種老面饅頭的比容均大于干酵母饅頭，且HB老面饅頭比容最大，說明老面饅頭比干酵母饅頭柔軟。老面在長時間發酵下形成了穩定的面筋網絡結構，持氣能力增強，比容增大。由表4可知，相對于干酵母饅頭，老面饅頭的質構特性均得到改善。其中，老面饅頭和干酵母饅頭的彈性無明顯差異；而硬度、膠著度和咀嚼度顯著低于干酵母饅頭，黏聚性和回復性均高于干酵母饅頭；原因是老面發酵充分，使饅頭富有彈性，內部結構細膩柔軟，使口感和質地優于干酵母饅頭，這也是老面饅頭的優勢所在[19]。

圖6 饅頭的比容注：不同小寫字母表示4種老面饅頭的比容在0.05水平存在顯著差異(n≥3)。

這4種老面饅頭中，HB老面饅頭品質最優，SX和SD老面饅頭質構特性最相近，YN老面饅頭質構特性稍低，但仍優于純酵母饅頭。其中，HB老面饅頭的比容最大，質構硬度、膠著度和咀嚼度最低，彈性和回復性最大，這可能與HB樣品中豐富的菌群結構有關。田曉會[20]發現，老面發酵面團的高徑比顯著大于酵母發酵，而且老面饅頭的高徑比略大于酵母饅頭。SX樣品中菌群多樣性雖然較低，但其質構特性仍優于純酵母發酵饅頭，可能與其中的醋酸桿菌屬有關。張月陽[21]研究發現，相對于安琪酵母發酵，另外添加醋酸菌可增加饅頭比容，使饅頭的硬度和咀嚼度顯著降低，且營養價值高。SD樣品的細菌菌群多樣性較低，真菌菌群多樣性較高，但SD老面饅頭的質構特性也優于純酵母饅頭，可能與其豐富的真菌菌群有關，真菌菌群可分泌豐富的酶類物質，對饅頭質構評價有所改善。方曉波等[22]發現在饅頭中添加一定量的真菌α-淀粉酶可提高饅頭的質構特性。楊春玲等[23]發現在饅頭粉中添加適量的葡萄糖氧化酶和真菌淀粉酶可改善面團的流變性和饅頭成品品質。

另外，對最大相對豐度前10的屬進行物種分類樹統計發現，HB、SX和SD樣品中存在豐富的戊糖片球菌(Pediococcus-pentosaceus)，HB和YN樣品中存在豐富的發酵乳桿菌(Lactobacillus-fermentum)、舊金山乳桿菌(Lactobacillus-sanfranciscensis)和魏斯氏乳酸菌(Weissella-cibaria)等。它們都是發酵食品中常見的優勢菌，而且發酵乳酸菌和魏斯氏乳酸菌都是益生菌。舊金山乳桿菌是傳統酸面團中的優勢乳酸菌，能很好地利用面粉中的主要糖類麥芽糖，對饅頭的風味和質構有重要的影響。

饅頭的比容主要是因為面團中的初始微生物的變化引起的。菌種變化不明顯，產氣量會減少，同質量的比容會變小，一定量的產酸酸化作用，可以促進酵母的生長代謝，增加酵母產氣量，增大面制品的比容[24]。由此可見，老面中的混合菌發酵可增加饅頭比容，改善饅頭的質構特性。

3 結論

4個老面樣品經鑒定共獲得667個細菌OTUs和331個真菌OTUs，細菌多樣性大于真菌多樣性。老面中優勢細菌菌門為厚壁菌門，真菌菌門為擔子菌門。HB、SX和SD老面樣品以片球菌屬為主，YN 老面樣品以乳桿菌屬為主。不同地區老面樣品豐度較大的細菌(屬)和真菌(屬)的種類差別較大，形成了特定的菌群結構。老面中豐富的菌群，可增加饅頭比容，降低饅頭硬度和咀嚼度，使饅頭更加柔軟，富有彈性。老面中還存在豐富的益生菌，可改善人的腸道健康，使饅頭營養價值更高。本研究可為傳統主食的產業化提供一定的參考；但本研究未對老面中的優勢菌種進行純化鑒定，還需要進一步探索。