熒光PCR技術在釀酒酵母細胞測定中的應用

申　敏

熒光PCR技術在釀酒酵母細胞測定中的應用

申敏

（長治職業技術學院山西長治046000）

聚合酶反應（PCR）作為一種敏感特意的核酸分子定性檢測的方法，在基因診斷中有著重要的作用，可是傳統PCR技術存在著諸多無法攻陷的難關，比如PCR后需要進行手工操作，無法定量，PCR產物容易污染等。隨著科技的發展，實時PCR技術誕生，有效的解決了傳統PCR技術的弊端，實現了定量分析，因此其被廣泛的用于食品工程中。文章采用實時熒光PCR技術應用于測定果汁中釀酒酵母細胞的含量，確立了一種實時熒光PCR檢測方法，提高了檢測的準確性，提升了檢測效率。

熒光PCR技術；釀酒酵母細胞；DNA

實時熒光PCR技術是將傳統PCR技術為基礎，逐漸發展而來的一種核酸定量技術，其被用于細胞研究中，是一種常見的細胞研究方式。借助熒光PCR技術能夠更加立體而又直觀的觀察肉眼所及的生命現象。當前，實時熒光PCR技術被普遍用于轉基因成分、動植物病毒、臨床樣品以及微生物等不同生物成分的檢測。筆者將實時熒光PCR技術用于探測果汁中的釀酒酵母細胞的含量，提升了檢測效率，明確了檢測方法的靈敏度與特異性。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

基因提取試劑盒、ABI7300 型熒光PCR儀。

1.2 實驗方法

測定釀酒酵母的檢出下限。溫度：28 ℃；時間：24 h。在1ml培養液中采用酵母基因組提取試劑盒提取其中的DNA，將提取出來的DNA進行稀釋。同時，選擇七份均為1ml的培養液，標號1、2、3……7，其中培養液1為原液，培養液2-7以10 、100 、1000 ……的倍率稀釋，利用傾注平板法計算培養液中的菌落數量，為了提升計數的準確性，不同培養液重復計算兩次。

測定果汁樣品中釀酒酵母的檢出下限。把1 ml的釀酒酵母培養液接種在20 ml的蘋果汁、橙汁以及葡萄汁中。培養場所：生化培養箱；溫度：30 ℃；時間：48 h。采用酵母基因組提取盒在1ml果汁培養液中提取釀酒酵母DNA，將提取出的DNA溶液分成七份，分別標號a、b、c……g，分別以10 、100 、1 000 ……的倍率進行稀釋處理，利用實時熒光技術對果汁中所存在的釀酒酵母進行檢出下限測定。同時選取1ml果汁培養液從10-1以10 倍稀釋度的方法一直稀釋到10-6，不同稀釋度分別選取1ml的培養液，采用傾注平板法對菌落進行計數，不同的稀釋度要進行兩次重復試驗，驗證結果的準確性。

2 結果與分析

測定不同濃度釀酒酵母DNA溶液的檢出下限，從圖1可知，不同濃度的DNA溶液都能夠獲得擴增曲線，而采用無菌雙蒸水作為空白對照進行測定，則不存在擴增曲線。有結果可知，培養液中釀酒酵母濃度是7×105cfu/mL。

圖1　實施熒光纖維技術測定釀酒酵母檢出下限

注：1-8是原液、不同濃度溶液以及空白組擴增曲線。

果汁中釀酒酵母的測定結果如圖2所示，不論是原液還是稀釋到不同的濃度，都存在顯著的擴增曲線，無菌雙蒸水空白組沒有出現擴增。最終結果表明，釀酒酵母在蘋果汁、橙汁、葡萄汁中的濃度分別是1.2×106、7×105、1.6×106cfu/mL。

圖2　釀酒酵母在橙汁中檢出下限

注：1-9分別為橙汁DNA原液、不同濃度、空白對照組擴增曲線。

圖3　釀酒酵母在蘋果汁中的檢出下限

注：1-9分別為蘋果汁DNA原液、不同濃度、空白對照組擴增曲線。

本研究試圖構建一種快速的果汁釀酒酵母熒光纖維檢測方法，采用這種方法對樣本當中的釀酒酵母進行檢測，整個過程只需要5h，可以及時的反映過程中樣本、環境的污染情況，為生產進程中產品質量控制提供了有效而又快速的檢測方法。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2019.05.31

申敏（1987- ），女，山西潞城人，碩士，研究方向：食品生物技術。

Q932

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2095-1205(2019)05-54-02