FOXP3和LAP蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床意義

王文靜　朱曉東　王經(jīng)榮　蔡清強(qiáng)　蔡文聘　房太勇

【摘要】 目的：探討FOXP3及LAP蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床意義，為臨床治療結(jié)直腸癌提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。方法：收集2016年9月-2017年6月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院診治的健康體檢者結(jié)直腸組織、患者結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織，并對(duì)各組織進(jìn)行H&E染色及病理診斷。運(yùn)用Western-blot檢測(cè)各組織中FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)。分析各組FOXP3、LAP蛋白的表達(dá)水平，以及兩種蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：（1）FOXP3及LAP蛋白在結(jié)直腸癌組的表達(dá)均高于結(jié)直腸腺瘤組及健康人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)水平與腺瘤上皮內(nèi)瘤變級(jí)別呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（3）FOXP3及LAP蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌細(xì)胞分化程度、腫瘤組織浸潤(rùn)深度、TNM分期呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：FOXP3、LAP蛋白可能參與了腺瘤向癌的進(jìn)展過程及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌; 結(jié)直腸腺瘤; LAP; FOXP3

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.080 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2019）17-0-04

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床上較常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的《2017年最新中國(guó)腫瘤現(xiàn)狀和趨勢(shì)》顯示：CRC的發(fā)病率及死亡率均高居第五位。表明CRC對(duì)我國(guó)人民的健康產(chǎn)生了重大威脅。對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制研究的深入能夠幫助大家更早、更多地篩查出結(jié)直腸癌，進(jìn)而達(dá)到早診早治、提高生存率的目標(biāo)。目前關(guān)于FOXP3及LAP蛋白在CRC及CRA組織中的表達(dá)情況的研究較少，兩種蛋白在CRC組織中的表達(dá)情況如何并未明確。因而本研究旨在檢測(cè)CRC及結(jié)直腸腺瘤（colorectal adenomas，CRA）組織中FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)情況，并分別觀察兩種蛋白與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，觀察這兩種蛋白對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)病進(jìn)程的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批后同意執(zhí)行。選取2016年9月-2017年6月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院診治的研究對(duì)象的組織標(biāo)本，每例樣本均詳細(xì)記錄對(duì)應(yīng)患者一般資料（包括姓名、性別、年齡、聯(lián)系方式、家庭住址）、臨床信息（包括現(xiàn)病史、既往史、個(gè)人史、臨床診斷、診斷時(shí)間、手術(shù)時(shí)間、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及影像學(xué)檢查結(jié)果等）、病理資料（包括病理號(hào)、詳細(xì)病理學(xué)描述、病理診斷等）、腫塊大小、浸潤(rùn)深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。其中健康人組：共收集25例，其中男12例，女13例，平均年齡（44±10）歲。結(jié)直腸腺瘤組：共收集25例，其中男16例，女9例，平均年齡（56±10）歲。腺瘤部位：直腸腺瘤5例，結(jié)腸腺瘤20例;腫瘤大小：>1 cm 16例，≤1 cm 9例;上皮內(nèi)瘤變：高級(jí)別11例，低級(jí)別14例。結(jié)直腸癌組：共收集33例，其中男19例，女14例，平均年齡（61±12）歲。直腸癌14例，結(jié)腸癌19例;腫瘤大小：>5 cm 11例，≤5 cm 22例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例;浸潤(rùn)深度：T1～T4分別為5、5、10、13例;分化程度：高分化5例，中分化20例，低分化8例;TNM分期：Ⅰ～Ⅳ期分別為：2、16、14、1例。

1.2 組織標(biāo)本

組織離體后分成兩部分，一部分組織迅速置入-196 ℃液氮速凍，后轉(zhuǎn)送入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?另一部分組織放入10%福爾馬林固定，行常規(guī)H&E染色，由專業(yè)病理科醫(yī)師進(jìn)行病理診斷，對(duì)于癌組織參照AJCC/UICC的結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)、中國(guó)結(jié)直腸腫瘤篩查、早診早治和綜合預(yù)防共識(shí)意見，并結(jié)合術(shù)中所見對(duì)結(jié)直腸癌組織進(jìn)行診斷、分級(jí)和分期。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 H&E染色 取組織標(biāo)本、沖洗、去除表面殘留糞便及血液，放入10%福爾馬林中固定大于12 h;脫水→透明→包埋→切片→貼片→脫蠟→染色→脫水Ⅰ和復(fù)染→脫水Ⅱ和透明→封藏。

1.3.2 Western-blot 提取組織蛋白，并采用BCA試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度;測(cè)定后將剩余蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE電泳（90 V 30 min，下層分離膠120 V 60 min）;采用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（100 V 60～90 min）;使用5%脫脂奶粉封閉后依次與一抗（鼠抗人FOXP3單克隆抗體1∶500稀釋;鼠抗人LAP單克隆抗體1∶2 000稀釋）、二抗（羊抗鼠單克隆IgG抗體1∶5 000稀釋）反應(yīng)，在避光條件進(jìn)行曝光、采圖，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，分析FOXP3和LAP蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（x±s）表示，三組間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，等級(jí)指標(biāo)采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康體檢者結(jié)直腸組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織H&E染色結(jié)果

各組織常規(guī)H&E染色病理圖，見圖1、圖2，A正常黏膜組織：腺體排列規(guī)則，腺體未見擁擠融合，核未見異型。B結(jié)腸腺瘤：腺體呈管狀，排列規(guī)則，未見背靠背現(xiàn)象，腺體未見融合，未見成角，未見間質(zhì)浸潤(rùn)。細(xì)胞輕度異型，位于基底層，未見病理性核分裂。C結(jié)腸腺癌：腺體不規(guī)則，呈背靠背融合，可見成角及壞死，間質(zhì)纖維化，浸潤(rùn)明顯。細(xì)胞重度異型，可見病理性核分裂。

2.2 健康體檢者結(jié)直腸組織、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中FOXP3及LAP蛋白表達(dá)情況

運(yùn)用Western Blot檢測(cè)各組織中FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)情況，見圖3，采用單因素方差分析對(duì)三組間的FOXP3及LAP蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析，見表1。

2.3 結(jié)直腸腺瘤組織中FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析

（1）采用獨(dú)立t檢驗(yàn)對(duì)FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行分析，見表2。FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)水平與腺瘤年齡、性別、腺瘤部位、大小相關(guān)性尚不確切，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（2）采用Spearman相關(guān)系數(shù)對(duì)FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)（等級(jí)指標(biāo)）之間的關(guān)系進(jìn)行分析，見表3，F(xiàn)OXP3蛋白的表達(dá)水平與腺瘤上皮內(nèi)瘤變級(jí)別呈正相關(guān)（rs=0.838），高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組（0.854±0.331，0.495±0.203），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。LAP蛋白的表達(dá)水平與腺瘤上皮內(nèi)瘤變級(jí)別呈正相關(guān)（rs=0.849），高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變表達(dá)水平高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（1.136±0.161，0.949±0.687），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

2.4 結(jié)直腸癌組織中FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析

（1）采用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，見表4。（2）采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)水平與等級(jí)指標(biāo)的關(guān)系，見表5。FOXP3蛋白與癌細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)（rs=0.464），分化程度越低，表達(dá)水平越高（依次為0.497±0.332、0.990±0.629、1.441±0.679），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007）;與腫瘤組織浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)（rs=0.588），浸潤(rùn)深度越深，表達(dá)水平越高（依次為0.574±0.582、0.687±0.268、0.815±0.347、1.488±0.732），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;與TNM分期呈正相關(guān)（rs=0.464），分期越晚，表達(dá)水平越高（依次為0.314±0.041、0.768±0.581、1.420±0.599、1.504），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。LAP蛋白的表達(dá)水平與癌細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)（rs=0.680），分化越低表達(dá)水平越高（依次為0.736±0.201、0.995±0.460、1.825±0.453），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;與腫瘤組織浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)（rs=0.543），浸潤(rùn)深度越深表達(dá)水平越高（依次為0.712±0.314、0.758±0.156、1.218±0.475、1.434±0.662），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）;與TNM分期呈正相關(guān)（rs=0.567），分期越晚表達(dá)水平越高（依次為0.637±0.197、0.937±0.403、1.480±0.641、1.198），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。

3 討論

目前認(rèn)為結(jié)直腸癌是由飲食結(jié)構(gòu)、生活環(huán)境、生活方式及遺傳等多方面因素相互協(xié)同作用的結(jié)果。而在發(fā)病機(jī)制研究方面，已有一些研究從不同角度探索，如突變細(xì)胞周期和失巢凋亡途徑、血管生成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等均在CRC的發(fā)生和進(jìn)展過程中起了重要作用[1-4]。本研究檢測(cè)健康人、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌組織中FOXP3及LAP蛋白的表達(dá)，探討兩者可能參與了腺瘤向癌的進(jìn)展過程及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

3.1 FOXP3及LAP蛋白與結(jié)直腸腺瘤

結(jié)直腸腺瘤是最常見的CRC癌前病變。70%～80%的結(jié)直腸癌是由結(jié)直腸腺瘤演變而來，這個(gè)過程需要10～15年的時(shí)間[5]。目前認(rèn)為腺瘤癌變的高危因素可能與患者年齡、飲食習(xí)慣、腺瘤的病理類型、大小、有無蒂、不典型增生程度等因素有關(guān)。但從其分子機(jī)制水平來看，似乎尚未發(fā)現(xiàn)能夠準(zhǔn)確預(yù)估腺瘤癌變風(fēng)險(xiǎn)的生物學(xué)指標(biāo)。Hua等[6]通過檢測(cè)結(jié)直腸腺瘤腫瘤微環(huán)境中的FOXP3+Tregs表達(dá)情況，他們發(fā)現(xiàn)腺瘤腫瘤微環(huán)境中FOXP3+Tregs表達(dá)增高。本研究中觀察到腺瘤組織中的FOXP3蛋白高于健康人，這與Hua等所提出的FOXP3+Tregs在腺瘤腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)相類似。筆者推測(cè)FOXP3蛋白對(duì)于腺瘤的發(fā)生可能有促進(jìn)作用。另一方面，筆者觀察到LAP蛋白在腺瘤組織中的表達(dá)與FOXP3蛋白相似，這提示LAP蛋白可能與FOXP3蛋白一樣對(duì)于腺瘤的發(fā)生有促進(jìn)作用。

2000年《WHO腫瘤病理學(xué)及遺傳學(xué)分類：消化系統(tǒng)腫瘤》將結(jié)直腸腺瘤定義為有上皮內(nèi)瘤變（intraepithelial neoplasia，IN）存在的病變，并將IN分為低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（LGIN）和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HGIN），其中有研究表明，80%的HGIN可在1年內(nèi)進(jìn)展為浸潤(rùn)癌。筆者研究發(fā)現(xiàn)FOXP3蛋白及LAP蛋白表達(dá)水平與上皮內(nèi)瘤變級(jí)別呈正相關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示FOXP3與LAP蛋白可能參與了結(jié)直腸腺瘤的癌變過程，但兩種蛋白之間的關(guān)系如何，是否為協(xié)同作用，仍需待后續(xù)研究證實(shí)。

3.2 FOXP3及LAP蛋白與結(jié)直腸癌

3.2.1 FOXP3蛋白與結(jié)直腸癌 2001年，Hinz等[7]首次在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞和腫瘤中檢測(cè)FOXP3蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FOXP3陽性的胰腺癌細(xì)胞能夠遏制活化T細(xì)胞的增殖、抑制TGF-β與IL-10的表達(dá)和分泌，進(jìn)而介導(dǎo)了免疫抑制和腫瘤免疫逃逸。這些都揭示了FOXP3蛋白在腫瘤免疫微環(huán)境中可能發(fā)揮著抑制免疫活性的作用，從而參與免疫抑制及腫瘤的免疫逃逸。Karanikas等[8]運(yùn)用免疫組化與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FOXP3蛋白在25種不同組織來源的腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)情況，證實(shí)了這25種腫瘤細(xì)胞系均有表達(dá)FOXP3蛋白。而在結(jié)直腸癌方面，Grimmig等[9-10]研究小組均發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞中FOXP3蛋白表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，即腫瘤惡性度越高，則FOXP3蛋白表達(dá)水平隨之升高，患者預(yù)后越差。本實(shí)驗(yàn)中所觀察到的結(jié)果與之一致：筆者發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中FOXP3蛋白表達(dá)高于健康人黏膜組織，推測(cè)FOXP3蛋白表達(dá)的上調(diào)可能在正常結(jié)直腸上皮發(fā)展為CRC的過程中起著一定的作用。

惡性腫瘤的預(yù)后與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌細(xì)胞分化程度、腫瘤組織浸潤(rùn)深度及TNM分期等因素密切相關(guān)。在本研究中FOXP3蛋白與上述臨床病理參數(shù)間的關(guān)系：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者FOXP3蛋白表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在FOXP3蛋白與癌細(xì)胞分化程度、腫瘤組織浸潤(rùn)深度及TNM分期的關(guān)系分析中，筆者發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞分化程度越差、腫瘤組織浸潤(rùn)深度越深、TNM分期越晚，F(xiàn)OXP3蛋白表達(dá)水平越高，這些均提示FOXP3蛋白可能參與腫瘤的發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。

3.2.2 LAP蛋白與結(jié)直腸癌 LAP在CRC中的研究主要圍繞LAP+CD4+T細(xì)胞：Zhong等[11]發(fā)現(xiàn)CRC腫瘤微環(huán)境中LAP+CD4+T細(xì)胞的表達(dá)量增多，可能是抑制機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸，使腫瘤進(jìn)行性生長(zhǎng)的因素之一。而LAP蛋白在腫瘤組織中是否表達(dá)及其作用機(jī)制研究較少，是否與同樣作為Tregs表面標(biāo)志物的FOXP3作用相同，目前仍未明確。在本實(shí)驗(yàn)中筆者通過Western blot檢測(cè)到LAP蛋白在CRC組織中有表達(dá)，并觀察到LAP蛋白在CRC組織中的表達(dá)高于健康人結(jié)腸組織，這與Kim等[12]所研究的FOXP3蛋白在腫瘤組織中富集相似，提示LAP蛋白可能與FOXP3蛋白一樣發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用。在進(jìn)一步分析其表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌細(xì)胞分化程度、腫瘤組織浸潤(rùn)深度及TNM分期等因素之間的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)LAP蛋白的表達(dá)與FOXP3蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)相類似：在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者組織中表達(dá)高，且癌細(xì)胞分化程度越差、腫瘤組織浸潤(rùn)深度越深、TNM分期越晚，LAP蛋白表達(dá)水平越高，說明LAP蛋白可能參與腫瘤的發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結(jié)果提示LAP蛋白與FOXP3蛋白在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能有共同作用，但這兩種蛋白表達(dá)的意義、調(diào)控機(jī)制及其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后的關(guān)系還有待進(jìn)一步探索。

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（收稿日期：2019-01-09） （本文編輯：何玉勤）