疫苗用原輔料中豬源性病毒PCR檢測(cè)方法的建立

谷海燕，律苗，丁玲，馬萌，張楠，李拓，李娜

疫苗用原輔料中豬源性病毒PCR檢測(cè)方法的建立

谷海燕，律苗，丁玲，馬萌，張楠，李拓，李娜

100176 北京生物制品研究所有限責(zé)任公司質(zhì)量檢定室（谷海燕、律苗、丁玲、馬萌、李拓、李娜），疫苗 5 室（張楠）

豬源性病毒是一類(lèi)廣泛寄生于豬體內(nèi)的病毒，其不只感染豬，對(duì)人和多種哺乳動(dòng)物也能造成感染，并可能致病[1-2]。2015 版《中國(guó)藥典》要求[3]，制備疫苗用的動(dòng)物細(xì)胞需要檢測(cè)豬源性病毒為陰性。目前生物制品中越來(lái)越多涉及到豬來(lái)源的原料或輔料，如疫苗生產(chǎn)中使用的胰蛋白酶和水解乳蛋白及明膠等。雖然目前法規(guī)并未將豬源性病毒納入原輔料質(zhì)控，但是一些豬來(lái)源原輔料有攜帶豬源性病毒的風(fēng)險(xiǎn)，其中包括豬圓環(huán)病毒 1（porcine circovirus 1，PCV1）、豬圓環(huán)病毒 2（porcine circovirus 2，PCV2）及豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）。確保生產(chǎn)用原輔料不攜帶豬源性病毒是生產(chǎn)出合格疫苗產(chǎn)品的保證，因此質(zhì)控原輔料中豬源性病毒至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)菌、質(zhì)粒、胰蛋白酶及水解乳蛋白 大腸桿菌（批號(hào)：2017053104-3）、金黃色葡萄球菌（批號(hào)：2017053104-3）、麻疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：20150902213）、風(fēng)疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：2015S0401）及所有標(biāo)準(zhǔn)菌毒株均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；水解乳蛋白（批號(hào)：1833902）和胰蛋白酶（批號(hào)：C01171008）均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司。PCV1、PCV2、PPV 陽(yáng)性質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白酶和酵母提取物購(gòu)自美國(guó) Oxid 公司；Taq DNA 聚合酶購(gòu)自日本 Takara 公司；DNA marker、Gel-red、病毒 DNA/RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司；瓊脂糖和氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；PCR 儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó) Bio-Rad 公司設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 基因組合成 根據(jù) GenBank 中的登錄號(hào)，PCV1（GenBank：AY193712.1）合成其 929 ~ 1655 bp 位點(diǎn)核酸序列，PCV2（GenBank：AY181946.1）合成其 1151 ~1584 bp 位點(diǎn)核酸序列，PPV（NC：001718）合成其 3001 ~ 3531 bp 位點(diǎn)核酸序列，合成的序列構(gòu)入 pUC57 載體，并轉(zhuǎn)化 top10 感受態(tài)細(xì)胞，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 陽(yáng)性模板 分別取 10 μl 3 種菌液，涂布于 Amp 抗性的 LB 平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，接種于 LB 液體培養(yǎng)基，220 r/min、37 ℃培養(yǎng) 16 h 后收集菌體，利用質(zhì)粒小提試劑盒對(duì)菌體中質(zhì)粒進(jìn)行提取，檢測(cè)濃度和純度后作為實(shí)驗(yàn)用陽(yáng)性對(duì)照模板。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成 利用文獻(xiàn)[4]報(bào)道的豬源性病毒檢測(cè)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后的引物稀釋成 10 μmol/L 備用，設(shè)計(jì)引物如表 1所示。

表 1 引物信息

1.2.4 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化 PCR 反應(yīng)體系為：陽(yáng)性模板 2.5 μl，上游引物（10 μmol/L）1.25 μl，下游引物（10 μmol/L）1.25 μl，Ex Taq 0.25 μl，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μl，10 × Buffer 2.5 μl，滅菌水補(bǔ)至 25 μl。將體系放入 PCR 儀，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 4 min，95 ℃變性 30 s，（50 ~ 64 ℃）退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸最后一次 10 min，4 ℃保溫。在 PCR 退火溫度設(shè)置中，設(shè)置了 50 ~ 64 ℃8 個(gè)退火溫度，PCR 完成后取 5 μl 樣品進(jìn)行凝膠電泳分析，確定其最佳退火條件。

1.2.5 方法驗(yàn)證[5-8]

1.2.5.1 中間精密度 由兩名實(shí)驗(yàn)人員分別進(jìn)行，時(shí)間間隔 24 h，連續(xù) 5 d 檢測(cè)同一陽(yáng)性樣品 5 次，評(píng)價(jià)此方法檢測(cè)原輔料中豬源性病毒的中間精密度。

1.2.5.2 專屬性驗(yàn)證 分別取陽(yáng)性樣品、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)品、麻疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品、風(fēng)疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品及無(wú)菌水，編號(hào)為 1 ~ 6，對(duì) 6 個(gè)樣品分別利用 3 對(duì)引物進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的微生物，驗(yàn)證此方法對(duì) PCV、PPV 檢測(cè)的專屬性。

1.2.5.3 檢測(cè)限驗(yàn)證 將提取的質(zhì)粒濃度調(diào)整為 1 ng/μl，再用無(wú)菌水將質(zhì)粒進(jìn)行 10 倍梯度稀釋，對(duì)稀釋后的質(zhì)粒進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，驗(yàn)證此方法對(duì)豬源性病毒的最低檢測(cè)限度。

1.2.5.4 重復(fù)性驗(yàn)證 同時(shí)取陽(yáng)性樣品 6 份，在相同的測(cè)量環(huán)境下，對(duì) 6 份樣品進(jìn)行 PCR檢測(cè)。驗(yàn)證此方法對(duì)原輔料中豬源性病毒檢測(cè)的重復(fù)性。

1.2.5.5 耐用性驗(yàn)證 取 2 份陽(yáng)性樣品，在相同的環(huán)境下配制反應(yīng)體系，然后將反應(yīng)體系分別在室溫放置 15、30 min后進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。驗(yàn)證在日常工作中室溫對(duì)體系耐用性造成的影響。

1.2.6 樣品檢測(cè) 取一批供試品胰蛋白酶及兩批水解乳蛋白，溶解后利用病毒基因組提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組 DNA，再進(jìn)行 PCR、電泳后凝膠成像，進(jìn)行 PCV1、PCV2 及 PPV 檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在引物濃度為 10 μmol/L 時(shí)候，PCR 擴(kuò)增效果很好。在 PCV1 和 PPV 實(shí)驗(yàn)組中設(shè)置了 50 ~57 ℃的退火溫度范圍，實(shí)驗(yàn)表明，在 54 ℃退火 30 s 時(shí)，PCR 擴(kuò)增效果最佳，擴(kuò)增條帶明亮清晰，條帶特異。在 PCV2 實(shí)驗(yàn)組中首先設(shè)置了 50 ~ 57 ℃退火溫度范圍，結(jié)果無(wú)特異條帶產(chǎn)生，將退火溫度提高至 64 ℃時(shí)，產(chǎn)生特異條帶，PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖 1。

2.2 中間精密度

經(jīng)過(guò) 2 名實(shí)驗(yàn)員每次間隔 24 h，連續(xù) 5 d 對(duì) 3 種陽(yáng)性對(duì)照連續(xù)進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，均在目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)生特異性條帶，中間精密度驗(yàn)證結(jié)果良好，結(jié)果如表 2 所示。

2.3 專屬性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該方法是否容易被實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的微生物污染，選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒作為 PCR 模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件，進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。結(jié)果表明，選擇的引物對(duì)實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的核酸模板不具有特異性，其專屬性良好（圖 2）。

2.4 檢測(cè)限驗(yàn)證

對(duì)稀釋后的陽(yáng)性樣品進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，驗(yàn)證此方法對(duì)豬源性病毒的最低檢測(cè)限度。結(jié)果如圖 3 所示，在陽(yáng)性質(zhì)粒稀釋度為 100 fg/μl 時(shí)仍可檢測(cè)出。

2.5 重復(fù)性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證 PCR 檢測(cè)原輔料中豬源性病毒的重復(fù)性，在同一條件下，取同一陽(yáng)性樣品分為 6 份，對(duì) 6 份樣品在相同的條件下進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。結(jié)果表明，6 次檢測(cè)均能在特異大小區(qū)域得到特異的條帶，該方法重復(fù)性較好，試驗(yàn)結(jié)果如表 3 所示。

2.6 耐用性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證 PCR 體系的耐用性，將配置好的 PCR 反應(yīng)體系分別在室溫放置 15 和 30 min，然后進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。結(jié)果表明，在放置 30 min 后，該反應(yīng)體系依然能很好檢測(cè)出特異的目標(biāo)條帶，結(jié)果如圖 4 所示。

bp M 1 2 3 4 4500300020001200800500 200

表 2 方法驗(yàn)證的中間精密度結(jié)果

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 4500300020001200800500200

2.7 樣品檢測(cè)結(jié)果

取一批供試品胰酶及兩批水解乳蛋白，樣品溶解后使用試劑盒提取病毒基因組 DNA，再運(yùn)用 PCR 對(duì)其進(jìn)行 PCV1、PCV2 及 PPV 檢測(cè)，電泳后凝膠成像結(jié)果如圖 5 所示，兩批樣品中 PCV1、PCV2 及 PPV 都呈陰性。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 4500300020001200800500 200

表 3 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

bp M 1 2 3 4 5 6 7 4500300020001200800500200

bp M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 20001000750500200100

M：DNA marker；1：PCV1 陽(yáng)性；2：水解乳蛋白 1 PCV1 檢測(cè)；3：水解乳蛋白 2 PCV1 檢測(cè)；4：胰酶 PCV1 檢測(cè)；5：PCV1 陰性對(duì)照；6：PCV2 陽(yáng)性；7：水解乳蛋白 1 PCV2 檢測(cè)；8：水解乳蛋白 2 PCV2 檢測(cè)；9：胰酶 PCV2 檢測(cè)；10：PCV2 陰性對(duì)照；11：PPV 陽(yáng)性；12：水解乳蛋白 1 PPV 檢測(cè)；13：水解乳蛋白 2 PPV 檢測(cè)；14：胰酶 PPV 檢測(cè)；15：PPV 陰性對(duì)照

圖 5 PCR 檢測(cè) 3 批樣品 PCV1、PCV2、PPV 結(jié)果

3 討論

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展以及對(duì)生物制品認(rèn)識(shí)越來(lái)越全面，人們對(duì)生物制品質(zhì)量控制的要求越來(lái)越高，要求我們對(duì)生物制品中的有效成分及雜質(zhì)含量能夠充分了解，并評(píng)估雜質(zhì)存在可能造成的影響。2010 年科學(xué)家 Victoria 等[9]利用基因組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)某疫苗中含有 PCV1 病毒基因組序列，隨后其他生物制品中發(fā)現(xiàn)豬源性病毒污染。人用生物制品中外源病毒成為了各國(guó)藥監(jiān)部門(mén)關(guān)注的焦點(diǎn)，也使得生物制品在外源因子質(zhì)量控制方面向前邁進(jìn)一步。本文利用合成病毒基因作為陽(yáng)性對(duì)照模板[4]，驗(yàn)證 PCR 法檢測(cè)疫苗用原輔料中豬源性病毒，分別從中間精密度、專屬性、檢測(cè)限、重復(fù)性和耐用性 5 個(gè)方面來(lái)驗(yàn)證該方法檢測(cè) PCV1、PCV2 及 PPV的可行性。結(jié)果達(dá)到預(yù)期，PCR 法可用于疫苗用原輔料中豬源性病毒檢測(cè)。

豬源性病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法眾多，傳統(tǒng)檢測(cè)有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、巢式 PCR 法、實(shí)時(shí)定量 PCR 法、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法、基因芯片等一系列方法[10]。其中熒光定量 PCR 檢測(cè)豬源性病毒靈敏度更高，但是熒光定量 PCR 法存在一些缺點(diǎn)，如成本高、技術(shù)要求高、極易出現(xiàn)假陽(yáng)性等。對(duì)疫苗生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)需要選擇一種靈敏度適合、特異性好、費(fèi)用更低、操作更簡(jiǎn)便、檢驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定的方法。本研究驗(yàn)證的 PCR 法檢測(cè)疫苗用原輔料中豬源性病毒具有高效、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，靈敏度和特異性也能達(dá)到我們的需求，可用于疫苗用原輔料中豬源性病毒快速檢測(cè)。

[1] Allan G, Krakowka S, Ellis J, et al. Discovery and evolving history of two genetically related but phenotypically different viruses, porcine circoviruses 1 and 2. Virus Res, 2012, 164(1-2):4-9.

[2] Sun SY, Wu D. Porcine parvovirus disease and research progress. Chin J Prev Vet Med, 2000, 22(s1):214-215. (in Chinese)

孫紹元, 吳丹. 豬細(xì)小病毒病及研究進(jìn)展. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2000, 22(s1):214-215.

[3] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. Volume 3, 2015. Beijing: China Medical Science Press, 2015. (in Chinese)

國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典. 2015年版三部. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015.

[4] Huang M, Lv BL, Yuan LY, et al. Development and verification of a PCR assay for porcine circovirus in live attenuated Japanese encephalitis vaccine. Chin J Biol, 2016, 29(12):1346-1348, 1354. (in Chinese)

黃敏, 呂冰凌, 袁良玉, 等. 乙型腦炎減毒活疫苗中豬圓環(huán)病毒PCR檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2016, 29(12): 1346-1348, 1354.

[5] Qian XL, Ren FF, Song CH, et al. Development and verification of a PCR assay for porcine circovirus in vaccines for human use and cells used for production. Chin J Biol, 2018, 31(5):543-546, 551. (in Chinese)

錢(qián)興麗, 任芳芳, 宋彩花, 等. 人用疫苗及生產(chǎn)用細(xì)胞中豬圓環(huán)病毒PCR檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2018, 31(5): 543-546, 551.

[6] Han Y, Guo ZL, Li W, et al. The study of verification of the qualitative method for GMO foods. J Inspection Quarantine, 2017, 27(1):5-9. (in Chinese)

韓玥, 郭錚蕾, 李偉, 等. 食品轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)的方法驗(yàn)證研究. 檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊, 2017, 27(1):5-9.

[7] Jiang LL, Wang XL, Wang HL, et al. Discussion of the performance verification procedures of the real-time quantitative polymerase chain reaction for determination of virus nucleic acid. J Mol Diagn Ther, 2012, 4(5):321-325. (in Chinese)

蔣玲麗, 王雪亮, 王華梁, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸方法學(xué)性能驗(yàn)證程序的探討. 分子診斷與治療雜志, 2012, 4(5):321- 325.

[8] Wang J, Lv BL, Meng L, et al. Method of loop mediated thermostatic amplification (LAMP) for detection of mycobacteria in Japanese encephalitis attenuated live vaccine was established//Proceedings of the 2013 China biological products annual conference and the 13th national symposium on biological products. Shanghai, 2013:185-189. (in Chinese)

王靜, 呂冰凌, 孟麗, 等. 乙型腦炎減毒活疫苗質(zhì)控中建立環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)檢測(cè)分枝桿菌//2013中國(guó)生物制品年會(huì)暨第十三次全國(guó)生物制品學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集. 上海, 2013:185-189.

[9] Victoria JG, Wang C, Jones MS, et al. Viral nucleic acids in live-attenuated vaccines: detection of minority variants and an adventitious virus. J Virol, 2010, 84(12):6033-6040.

[10] Mcclenahan SD, Krause PR, Uhlenhaut C. MolecuLar and infectivity studies of porcine circovirus in vaccines. Vaccine, 2011, 29(29-30): 4745-4753.

“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2018ZX09738003）

李娜，Email：115735267@qq.com

2019-03-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.016