3種龍膽草粗提物的抑菌活性及穩(wěn)定性

廖雯　孫愛(ài)群　劉新穎　盧虹

摘要：以從貴州省六盤(pán)水市采集的頭花龍膽（Gentiana cephalantha）、紅花龍膽（G. rhodantha）及于畢節(jié)市采集的翼萼龍膽（G. pterocalyx）為材料，用超聲、浸提及回流法提取粗提物，采用濾紙片擴(kuò)散法，以抑菌圈大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，檢測(cè)3種龍膽草粗提物對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的抑菌活性，考察氧化劑、溫度、pH值及紫外線對(duì)龍膽草粗提物抑菌活性的影響。結(jié)果表明，頭花龍膽與翼萼龍膽用3種提取方法所得粗取物的抑菌效果大致相當(dāng)，而紅花龍膽用超聲與浸提法所得提取物的抑菌效果大致相當(dāng)，回流法所得提取物的抑菌效果稍弱。頭花龍膽浸提液對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）均為0.100 g/mL，紅花龍膽浸提液對(duì)以上3種菌的MIC分別為0.050、0.100、0.050 g/mL，翼萼龍膽浸提液對(duì)以上3種菌的MIC分別為0.150、0.100、0.150 g/mL。由結(jié)果可以看出，氧化劑能夠增強(qiáng)3種龍膽草的抑菌活性;3種龍膽草提取物具有熱穩(wěn)定性;酸性環(huán)境的抑菌活性大于堿性環(huán)境，當(dāng)pH值為4時(shí)，抑菌效果最好;在紫外線照射下，抑菌活性變化不大。綜合對(duì)3種細(xì)菌的抑菌效果可知，研究所用的3種龍膽可以被開(kāi)發(fā)成天然的抑菌劑。

關(guān)鍵詞：紅花龍膽草;翼萼龍膽草;頭花龍膽草;大腸桿菌;金黃色葡萄球菌;銅綠假單胞菌;最低抑菌濃度

中圖分類(lèi)號(hào)： R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0198-04

龍膽屬（Gentiana）植物在我國(guó)有247種[1]，在貴州省有29種1個(gè)變種，其中在貴州六盤(pán)水有13種[2-3]。頭花龍膽（G. cephalantha）具有瀉肝火、清下焦、除濕熱的功效[4]。紅花龍膽（G. rhodantha）為《中華人民共和國(guó)藥典》2015版中新收載的品種，具有清熱除濕、解毒、止咳的功效[5]。目前尚未見(jiàn)翼萼龍膽（G. pterocalyx）入藥的報(bào)道。龍膽屬植物大多含有龍膽苦苷，徐竺婷等認(rèn)為，龍膽苦苷對(duì)口腔內(nèi)的多種細(xì)菌具有抑制作用[6];賀平等認(rèn)為，以白花龍膽為主成分的龍膽花丸對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用，最低抑菌濃度（MIC）為 6.25～12.5 mg/mL[7];藍(lán)玉簪龍膽（G. veitchiorum）對(duì)金黃色葡萄球菌也有一定的抑制作用[8];滇龍膽（G. rigescens）對(duì)21株試驗(yàn)細(xì)菌有抗菌作用，對(duì)10株致齲菌的MIC大于 20 mg/mL[9];以龍膽（G. scabra）等10味中草藥組成的瀉痢停制劑對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌有較好的抑制作用[10];從云霧龍膽（G. nubigena）中分離的內(nèi)生菌對(duì)蘋(píng)果腐爛病病菌的生長(zhǎng)有顯著的拮抗作用[11]。目前尚未見(jiàn)關(guān)于頭花龍膽、紅花龍膽及翼萼龍膽的抑菌作用及穩(wěn)定性的報(bào)道。本試驗(yàn)以頭花龍膽、翼萼龍膽和紅花龍膽為材料，比較不同方法提取的粗提物對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果及抑菌穩(wěn)定性，旨在為開(kāi)發(fā)天然抑菌劑提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料及供試菌種

試驗(yàn)材料為頭花龍膽（采自貴州省六盤(pán)水市鐘山區(qū)韭菜坪，海拔 2 600 m）、紅花龍膽（采自貴州省六盤(pán)水市水城縣俄腳村，海拔1 750 m）、翼萼龍膽（采自貴州省畢節(jié)市威寧縣艾家坪村，海拔2 300 m）。將3種龍膽洗凈，干燥至恒質(zhì)量，粉碎，備用。

供試菌種大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由六盤(pán)水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)于2017年2—5月在六盤(pán)水師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2儀器與試劑

SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-601恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器廠;303A-2型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;MLS-3750高壓滅菌鍋，日本三洋電器股份有限公司;DFT-200手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司;SHB-3 循環(huán)水多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠。

主要試劑：NaOH、HCL、NaCl、95%乙醇，均為分析純;牛肉膏，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司;純化瓊脂，杭州微生物試劑有限公司;青霉素，中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1粗提液的制備稱(chēng)取頭花龍膽、紅花龍膽及翼萼龍膽全草，分別用超聲、浸提及索式回流方法提取。經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)篩選出的提取條件如下：3種方法所用提取溶劑為70%乙醇，料液比為1 g ∶20 mL。提取液經(jīng)抽濾，于80 ℃濃縮至生藥含量為 1 g/mL 的原液，于4 ℃冰箱密封保存，備用。

超聲提取參照翁貴英等的方法[12]，提取時(shí)間為40 min。索式回流提取方法為70 ℃回流提取2次，每次1 h，合并2次提取液。浸提提取方法為70 ℃恒溫水浴鍋浸提2 h。

1.3.2供試菌種的活化及菌懸液的制備培養(yǎng)基的配制及供試菌的活化參照沈萍等的方法[13]。將活化的供試菌種轉(zhuǎn)接后于37 ℃培養(yǎng)24 h，待菌體達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用無(wú)菌生理鹽水制成菌體濃度為10-6～10-7 CFU/mL 的菌懸液，待用。

1.3.3抑菌活性的檢測(cè)采用濾紙片擴(kuò)散法檢測(cè)3種龍膽的抑菌活性。用6 mm打孔器打取1號(hào)定性濾紙片，滅菌后分別放入不同方法提取的3種龍膽草的提取液、陰性對(duì)照無(wú)菌水及陽(yáng)性對(duì)照青霉素溶液中浸泡2 h，瀝干待用。

配制培養(yǎng)基，倒平皿，冷卻后每個(gè)平皿加50 μL菌懸液，用無(wú)菌三角涂布棒將其涂布均勻。將用不同藥液浸泡過(guò)的濾紙片等距放置在涂有菌液的平皿上，于37 ℃培養(yǎng)24 h，設(shè)3次重復(fù)。用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑[抑菌圈直徑包括濾紙片直徑（6 mm），抑菌圈直徑為6 mm表示無(wú)抑菌作用]，記錄數(shù)據(jù)，取平均值。陰性對(duì)照無(wú)菌水無(wú)抑菌作用，陽(yáng)性對(duì)照青霉素有抑菌作用，表明試驗(yàn)有效。抑菌圈直徑越大，表示抑菌活性越強(qiáng)。

1.3.4最低抑菌濃度的測(cè)定對(duì)于用浸提法提取的粗提物，采用試管稀釋法稀釋后測(cè)定MIC[14]，分為大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌3個(gè)大組，每個(gè)大組又分為3個(gè)小組，分別為頭花龍膽、紅花龍膽及翼萼龍膽組，每個(gè)小組取12支無(wú)菌試管，并編號(hào)為1～12，其中1～10號(hào)試管分別加1.00、1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、1.95 mL培養(yǎng)液與1.00、0.80、0.70、0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05 mL 提取液，使提取液最終濃度分別為0.500、0.400、0.350、0.300、0.250、0.200、0.150、0.100、0.050、0.025 g/mL，再各加0.1 mL供試菌，混勻;11號(hào)試管加2 mL培養(yǎng)液與0.1 mL供試菌，記作CK1;12號(hào)試管只加2 mL粗提液，記作CK2。將全部試管于37 ℃培養(yǎng)24 h，取出振蕩，觀察各管細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。為了提高準(zhǔn)確性，將初步判斷為澄清透明的試管溶液涂布于平板培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，再次觀察，將完全無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的平板對(duì)應(yīng)的粗提物濃度作為最低抑菌濃度。

1.3.5氧化劑對(duì)3種龍膽草抑菌活性的影響用浸提法提取獲得龍膽草粗提液，供試菌為銅綠假單胞菌。參照“1.3.3”節(jié)的方法，根據(jù)抑菌圈直徑的大小檢測(cè)抑菌穩(wěn)定性。

將原液制成含0.075% H2O2的樣液，以原液與0.075% H2O2為對(duì)照。

1.3.6溫度對(duì)3種龍膽草抑菌活性的影響將原液分別于40、60、80、100 ℃水浴及121 ℃高壓濕熱條件下處理30 min，以未加熱處理的原液作為對(duì)照。

1.3.7pH值對(duì)3種龍膽草抑菌活性的影響將原液用 1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)成pH值為2、4、6、8、10、12的溶液，以未調(diào)pH值的原液作為對(duì)照。

1.3.8紫外線對(duì)3種龍膽草抑菌活性的影響將原液分別于15 W紫外燈下照射30、60、90、120 min，以未經(jīng)紫外線處理的原液作為對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.13種龍膽草的超聲提取物的抑菌活性比較

由圖1中3種龍膽草超聲提取物對(duì)3種細(xì)菌的抑菌圈直徑可知，陰性對(duì)照無(wú)菌水無(wú)抑菌作用，陽(yáng)性對(duì)照青霉素有抑菌作用，可以認(rèn)為試驗(yàn)有效。3種供試菌的抑菌活性由大到小排序?yàn)榧t花龍膽>頭花龍膽>翼萼龍膽。可見(jiàn)3種龍膽草的超聲提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性較強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性較弱，紅花龍膽的超聲提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為（14.14±1.70） mm。

2.23種龍膽草浸提提取物的抑菌活性比較

由圖2可知，3種龍膽草對(duì)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌活性的排序?yàn)榧t花龍膽>頭花龍膽>翼萼龍膽，而對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性排序?yàn)榧t花龍膽>翼萼龍膽>頭花龍膽。頭花龍膽浸提物對(duì)3種菌的抑菌活性大致相當(dāng);紅花龍膽浸提物對(duì)3種菌的抑菌活性排序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌>大腸桿菌>銅綠假單胞菌;翼萼龍膽浸提物對(duì)3種菌的抑菌活性從強(qiáng)至弱排序?yàn)殂~綠假單胞菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。綜上可以看出，浸提提取的紅花龍膽浸提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為（14.66±0.82） mm。

2.33種龍膽草回流提取物的抑菌活性比較

由圖3可知，3種龍膽草的回流提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果排序?yàn)轭^花龍膽>紅花龍膽>翼萼龍膽，對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果排序?yàn)榧t花龍膽>頭花龍膽>翼萼龍膽，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果排序?yàn)轭^花龍膽>翼萼龍膽>紅花龍膽。回流提取的紅花龍膽提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑為（13.54±1.81） mm。

此外，本研究還對(duì)黑曲霉與根霉進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，3種龍膽草提取物對(duì)黑曲霉、根霉無(wú)抑制作用。綜上所述，3種方法提取的頭花龍膽粗提物的抑菌活性大致相當(dāng);紅花龍膽用超聲法與浸提法所得提取物的抑菌活性相當(dāng)，用回流法得到的提取物的抑菌活性稍弱;翼萼龍膽用3種方法得到的提取物的抑菌作用也大致相當(dāng)。由于3種提取方法的效果大致相當(dāng)，所以下列試驗(yàn)采用成本低廉的浸提法提取。

2.43種龍膽草浸提液的最低抑菌濃度

由表1可知，頭花龍膽浸提液對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的MIC為0.100 g/mL，紅花龍膽浸提液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC為0.050 g/mL，對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為0.100 g/mL;翼萼龍膽浸提液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC為0.150 g/mL，對(duì)銅綠假單胞菌MIC為0.100 g/mL。

2.5氧化劑對(duì)3種龍膽草浸提液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，3種龍膽草浸提液的抑菌圈直徑排序?yàn)樵?氧化劑（H2O2）>H2O2>原液，其中頭花龍膽浸提液經(jīng)氧化劑（H2O2）處理后活性增加的最多，抑菌圈直徑達(dá)（23.12±1.18） mm，說(shuō)明氧化劑能夠增強(qiáng)龍膽草浸提液的抑菌活性。3種龍膽草浸提液的抑菌成分受氧化劑的影響較小，可能因?yàn)檠趸瘎┍旧韺?duì)細(xì)菌就有抑制作用。

2.6溫度對(duì)3種龍膽草浸提液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，與原液相比，隨著溫度的升高，龍膽草浸提液的抑菌活性逐漸降低，但降低幅度較小。總體上可以看出，頭花龍膽與紅花龍膽浸提液的抑菌穩(wěn)定性較高，在100、121 ℃ 時(shí)仍具有較高的抑菌活性。翼萼龍膽的抑菌穩(wěn)定性稍低于頭花龍膽、紅花龍膽。綜合以上結(jié)果可以得出，3種龍膽草的抑菌成分對(duì)熱的穩(wěn)定性較好。

2.7pH值對(duì)3種龍膽草浸提液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖6可以看出，在pH值為2～12的范圍內(nèi)，3種龍膽草浸提液的抑菌活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但是下降幅度較小，在pH值為4時(shí)抑菌活性達(dá)到最大值，說(shuō)明3種龍膽草[CM（25]浸提液的抑菌成分受到pH值的影響較小。 此外由圖6可以看出，酸性環(huán)境能提高龍膽草的抑菌活性，堿性環(huán)境則會(huì)降低龍膽草浸提液的抑菌活性。

2.8紫外線對(duì)3種龍膽草浸提液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖7可以看出，隨著紫外線處理時(shí)間的增加，3種龍膽草浸提液的抑菌活性逐漸下降，但是下降幅度較小。紫外線處理30 min時(shí)，3種龍膽草的抑菌活性與對(duì)照相比相差不大;紫外線處理90 min時(shí)，翼萼龍膽的抑菌活性變化仍然很小，表明翼萼龍膽的穩(wěn)定性較高。綜合以上結(jié)果可以看出，3種龍膽草的抑菌成分對(duì)紫外線較穩(wěn)定。

3討論與結(jié)論

提取粗提物的方法很多，有回流法、浸提法及超聲提取法等。李世傳等認(rèn)為，金銀花的超聲法與索式法提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果略好于普通回流法[15];張雅靜等通過(guò)對(duì)苦瓜抑菌作用的研究，認(rèn)為抑菌效果從好至差排序?yàn)槌曁崛》?回流提取法>浸提法[16]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)超聲、回流、浸提3種提取方法的比較，認(rèn)為頭花龍膽與翼萼龍膽用3種方法所得提取物的抑菌效果大致相當(dāng)，而紅花龍膽的超聲法與浸提法所得提取物的抑菌效果大致相當(dāng)，回流法所得提取物的抑菌效果稍弱。說(shuō)明不同植物用不同方法所得提取物的抑菌效果不盡相同。

原江鋒等認(rèn)為，連翹提取物經(jīng)氧化劑處理后，抑菌活性大為降低，其對(duì)氧化劑的抑菌穩(wěn)定性較弱[17];本試驗(yàn)表明，氧化劑處理可使3種龍膽草的抑菌活性增強(qiáng)，說(shuō)明氧化劑對(duì)3種龍膽草提取物抑菌活性的影響較小，3種龍膽草對(duì)氧化劑的穩(wěn)定性較好。3種龍膽草提取物對(duì)高溫具有較好的熱穩(wěn)定性。用紫外線照射3種龍膽草提取物，其抑菌活性仍然較高，說(shuō)明3種龍膽草的抑菌成分對(duì)紫外線較穩(wěn)定。3種龍膽草提取物在酸性環(huán)境下的抑菌活性較強(qiáng)，在pH值為4的活性最大，在堿性環(huán)境中時(shí)，龍膽草提取物的抑菌活性逐漸降低，但是下降幅度較小，與任曉靜等對(duì)甜葉菊[18]、仇燕等對(duì)菜芙蓉的研究結(jié)果[19]具有一致性。不同的是仇燕等研究得出，菜芙蓉提取物隨著pH值的升高，其抑菌活性的下降速度變快[19]。

清熱解毒中草藥具有一定的抑菌作用，從抑菌效果來(lái)看，翼萼龍膽草浸提物對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌作用好于頭花龍膽草浸提物，回流提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果好于紅花龍膽，而紅花龍膽具清熱、解毒的功效，說(shuō)明翼萼龍膽也可以作為清熱解毒的藥物使用。

參考文獻(xiàn)：

[1]何廷農(nóng)，劉尚武，吳慶如. 中國(guó)植物志（第62卷：龍膽科）[M]. 北京：科學(xué)出版社，1988：1-257.

[2]孫愛(ài)群，林長(zhǎng)松，左經(jīng)會(huì)，等. 貴州龍膽屬植物資源調(diào)查及利用[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（10）：23-27.

[3]孫愛(ài)群，左經(jīng)會(huì)，林長(zhǎng)松，等. 六盤(pán)水市龍膽科植物資源及藥用價(jià)值研究[J]. 北方園藝，2012（2）：178-181.

[4]左經(jīng)會(huì)，向紅，林長(zhǎng)松，等. 六盤(pán)水藥用植物[M]. 北京：科學(xué)出版社，2013：360.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：一部[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：151-152.

[6]徐竺婷，李鳴宇. 10種中藥有效成分抑制口腔主要致病菌比較[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2000，17（4）：277-279.

[7]賀平，朱曉莉，劉航，等. 藏藥十五味龍膽花丸的體外抑菌活性研究[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2016，25（2）：3-5.

[8]劉菁菁，李旭波，耿錚，等. 藍(lán)玉簪龍膽提取物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（7）：1024-1027.

[9]李艷紅，劉娟，楊麗川，等. 6種云南天然藥物對(duì)口腔優(yōu)勢(shì)菌的抗菌活性測(cè)定[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，28（2）：199-202，207.

[10]武瑞，郭世寧，康世良. 中草藥瀉痢停治療雛雞腹瀉病的臨床試驗(yàn)研究[J]. 中獸醫(yī)學(xué)雜志，2001（4）：3-4.

[11]黃海東，李曉雁，楊紅澎，等. 龍膽內(nèi)生菌的分離鑒定及其對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的拮抗作用[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（6）：215-218.

[12]翁貴英，孫愛(ài)群，王緒英，等. 超聲提取頭花龍膽總黃酮的工藝優(yōu)化[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：193-195.

[13]沈萍，范秀容，李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版.北京：高等教育出版社，1999：50-54.

[14]周德慶，徐德強(qiáng). 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2013：154-155.

[15]李世傳，杜華英，熊建華，等. 金銀花葉抑菌成分的提取及效果研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2015，36（6）：6-10.

[16]張雅靜，文良娟，王嬌，等. 苦瓜抑菌作用的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34（18）：132-136.

[17]原江鋒，王大紅，何靈美，等. 連翹葉提取物抑菌作用以及穩(wěn)定性研究[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34（5）：57-59，65.

[18]任曉靜，奚印慈，洪怡藍(lán)，等. 甜葉菊提取物抑菌作用的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（14）：174-177.

[19]仇燕，王明珠，趙紫華. 菜芙蓉總黃酮提取物抑菌作用及其穩(wěn)定性研究[J]. 北方園藝，2016（8）：150-153.