解淀粉芽孢桿菌LZN01對西瓜專化型尖孢鐮刀菌的抑制效應

史一然 徐偉慧 呂智航

摘要：西瓜專化型尖孢鐮刀菌（FON）是西瓜枯萎病的病原菌，生物防治是控制西瓜枯萎病的重要手段。研究解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON的抑制效應。試驗結果表明，解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON的抑菌率為57.07%;FON孢子懸液與解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵上清液按體積比1 ∶ 1混合培養6、12、24 h，孢子萌發抑制率分別為86.21%、67.50%、56.04%，抑制率隨時間的增加呈下降趨勢;經解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵上清液處理，通過掃描電鏡觀察發現FON菌絲細胞膨大且畸變，菌絲表面嚴重受損;溫度在-20 ℃～60 ℃之間，pH值在4～9之間，解淀粉芽孢桿菌LZN01的發酵液抑菌效果穩定;解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵上清液抑菌能力穩定。綜上所述，解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON具有較好的抑制能力，且抑菌效果穩定，在西瓜枯萎病生物防治方面具有較大的開發和應用價值。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;抑制作用;孢子萌發;發酵上清液;西瓜專化型尖孢鐮刀菌;生防菌劑

中圖分類號： S436.5? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0141-05

西瓜在世界園藝中占有重要比例，我國是西瓜生產和消費的第一大國，年種植面積為200萬hm2，年產量為7 000余萬t[1]。西瓜枯萎病是由西瓜專化型尖孢鐮刀菌（FON）引起的一種嚴重的世界性土傳維管束病害，是導致西瓜產量和品質降低（含糖量下降）最重要的因素之一，該病輕則導致西瓜減產10%～40%，重則減產可達80%以上甚至絕收，是造成西瓜經濟損失最大的病害之一[2]。隨著西瓜種植面積的逐年擴大，連作重茬導致病原基數升高，更加重了西瓜枯萎病的發生。探究有效防治西瓜枯萎病的方法，已經成為當今西瓜生產上亟須解決的問題[3]。

近年來，針對西瓜枯萎病的防治，國內外學者已經做了大量研究。目前，我國培育的抗病品種主要有西農8號、京抗1號、秀麗等[4-6]，但由于西瓜遺傳多樣性極低，因此可被選育的抗病種質資源非常有限[7]，而且常規育種周期長，進度慢，技術難度系數高，所育出的抗病品種只是相對抗病，生命力不強，易受周圍環境的影響[8]，無法從根本上解決問題;化學藥劑對西瓜枯萎病的治理能夠得到顯著效果[9-11]，但其所產生的藥物殘留會造成環境污染，傷害非靶標生物，甚至破壞生態平衡，嚴重制約西瓜產業的綠色發展;利用葫蘆、冬瓜等植物的根類進行嫁接栽培對防治西瓜枯萎病的治理有很好的效果并得到廣泛應用[12]，但工作量大，會影響西瓜正常的生長發育及果實的口感，西瓜品質也會下降[2];物理手段防治西瓜枯萎病能夠起到一定的防治效果[13]，但工作量較大。基于以上防治措施存在的問題，生物防治利用有益微生物或拮抗微生物抑制西瓜尖孢鐮刀菌的生長，降低土壤中該病菌的數量，從而控制枯萎病病害的發生，是目前最有效且安全的防治手段[3]。因此，筆者所在實驗室從西瓜根際篩選出一株FON的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌LZN01，研究其發酵上清液的穩定性和抑菌效應，旨在為后續生防菌劑的生產應用和貯存提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥品 磷酸緩沖液（pH值為7.2）：配制磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉儲液，稱取磷酸氫二鈉138 g和磷酸二氫鈉142 g，分別溶于適量水中，待其溶解后定容至1 L;量取 72 mL 磷酸氫二鈉溶液和28 mL磷酸二氫鈉溶液，混合后即得到pH值為7.2的磷酸緩沖溶液，4 ℃冰箱保存;2.5%戊二醛緩沖溶液：0.2 mol/L磷酸緩沖液50 mL加25%戊二醛溶液10 mL，雙蒸水定容至100 mL。

1.1.2 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200 g、葡糖糖20 g、蒸餾水1 000 mL，固體加瓊脂，120 ℃滅菌20 min;溶菌肉湯（LB）培養基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 8 g、蒸餾水1 000 mL，120 ℃滅菌20 min。

1.1.3 菌株來源 解淀粉芽孢桿菌LZN01于2016年4月從黑龍江省齊齊哈爾市扎龍自然保護區采集的腐殖土和黑龍江省田雨綠色農業工程有限公司的雞糞堆肥中取樣，并經常溫（30 ℃）及高溫（50 ℃）多代馴化、篩選得到;尖孢鐮刀菌由東北農業大學園藝實驗室提供。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 生理生化鑒定 生理生化試驗方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》[14]，接觸酶試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗、耐鹽性試驗（2、5、7、10、20 g）、檸檬酸銨利用試驗、酷素水解試驗方法均參照文獻[15]。

1.2.2 菌株16S rDNA測序 以LZN01菌株基因組DNA為模板，采用細菌通用引物sgF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進行PCR擴增。反應體系為2.0 μL10×Ex Taq buffer，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix，0.8 μL Primer 1，0.8 μL Primer 2，0.5 μLTemplate，0.2 μL 5 U Ex Taq，14.1 μL ddH2O。反應條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，24個循環;72 ℃延伸10 min。序列由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測定，菌株測序結果于NCBI進行Blast比對，鑒定菌株[16-17]。

1.3 解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON菌絲生長的影響

解淀粉芽孢桿菌LZN01菌株對FON菌絲生長的影響：采用平板對峙培養法，在PDA平板中央接入已培養5 d的FON菌碟（直徑為5 mm），培養48 h后，在距致病菌2 cm處接入已培養24 h的解淀粉芽孢桿菌LZN01，置于30 ℃恒溫暗箱中5 d，以不接解淀粉芽孢桿菌LZN01的平板為對照，待對照組菌株長至滿盤時觀察[18]。

解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液對FON菌絲生長的影響[19]：將解淀粉芽孢桿菌LZN01菌體接入盛有100 mL LB液體培養基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養12 h，制成種子液。再將1 mL種子液接種于100 mL LB液體培養基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養48 h后，在10 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清液，再將上清液用0.02 μm過濾器過濾，即得發酵上清液，保存于4 ℃冰箱備用。

將解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵上清液與未凝固的培養基按體積比1 ∶ 1、1 ∶ 3混合，以培養基與無菌水按同樣比例混合作為空白對照，待培養基凝固后，在平板上接種FON菌碟（直徑為5 mm），30 ℃培養5 d（3組平行試驗），待對照菌落長滿平板2/3時，用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。

1.4 解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液對FON形態的影響試驗

挑取PDA平板中培養5 d的FON菌絲懸浮于無菌水中，經過6層紗布過濾后，室溫下10 000 r/min離心5 min收集孢子，用PDA培養基制備孢子懸浮液并調節濃度至 106 CFU/mL。將解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液與FON孢子懸液按體積比1 ∶ 1混合后，放入培養皿（鋪著已滅菌的濕潤濾紙）中，以無菌水與FON的孢子懸液按同樣比例混合作為空白對照，在30 ℃黑暗條件下培養12 h。分別吸取混合液滴在蓋玻片上風干，使用2.5%戊二醛緩沖液固定，置于4 ℃冰箱中過夜，再用pH值為7.2的磷酸緩沖液將其固定，沖洗2次，依次將樣品置于濃度為50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液中脫水置換，每級脫水時間為10～15 min，最后置換100%乙醇加無水硫酸銅脫水10～15 min，置于冷凍室固化1夜，每組3個平行，掃描電鏡下觀察其形態[20]。

1.5 解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液對FON孢子萌發的影響

按“1.4”節中方法制備孢子懸浮液，向已滅菌的離心管中加入10 μL孢子懸液，按體積比1 ∶ 1加入解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液，以同樣比例的FON孢子懸液和無菌水為對照，混合均勻后，倒入無菌凹玻片中，放在鋪有濕潤濾紙的培養皿中，30 ℃黑暗條件下培養，每組3個平行試驗。分別在6、12、24 h時鏡檢，觀察孢子萌發情況。按下列公式計算孢子萌發抑制率。

孢子萌發率=孢子萌發數總孢子數×100%;

孢子萌發抑制率=對照孢子萌發率-處理孢子萌發率對照孢子萌發率×100%。

1.6 解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液抑菌能力的穩定性試驗

1.6.1 pH值對抑菌能力的影響 將發酵上清液分別用 1 mol/L HCl或0.5 mol/L NaOH調節pH值為3、4、5、6、7、8、9、10，處理1 h，再將pH值調回到初始pH值（初始pH值為6.6），測定其抑菌活性，以無菌水作對照，比較處理前后菌絲變化情況，計算抑菌率。

1.6.2 溫度對抑菌能力的影響 將發酵上清液分別置于-20、0、4、20、60、80、100、120 ℃條件下保溫30 min，室溫平衡 3 min 后測定解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON的抑菌率。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

菌株解淀粉芽孢桿菌LZN01生理生化指標鑒定見表1，接觸酶試驗陽性，淀粉水解試驗陽性，V-P試驗陽性，不能利用檸檬酸銨，酷素水解試驗陽性。菌株在NaCl含量>5%的固體培養基中不生長。

2.2 解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON菌絲生長的影響

平板對峙試驗表明，當對照FON（圖2-A）長滿培養皿時，試驗組FON的生長呈現規避解淀粉芽孢桿菌LZN01的現象（圖2-B），說明解淀粉芽孢桿菌LZN01能夠抑制FON的菌絲生長;當解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵上清液與培養基按體積比1 ∶ 1和1 ∶ 3比例混合后，FON菌落直徑分別為 2.77、1.79 cm（圖2-C、圖2-D），其抑菌率分別為34.82%、57.07%，說明解淀粉芽孢桿菌LZN01能夠顯著抑制FON的生長。

2.3 解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON微觀形態的影響

本試驗用解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵上清液處理FON后，通過電鏡觀察發現，FON菌絲數量明顯減少，菌絲變細，表面變得粗糙、模糊，菌絲末端膨大變形（圖3-B），說明FON菌絲生長受到抑制且細胞表面受損（圖3）。此結果與菌落生長受抑制的試驗結果一致。

2.4 解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON孢子萌發的影響

由圖4可知，FON孢子懸液與解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液按體積比1 ∶ 1混合，培養6、12、24 h后的孢子萌發率分別為2.40%、18.20%、42.17%，孢子萌發抑制率分別為 86.21%、67.50%、56.05%，隨著時間的增加孢子萌發抑制率呈下降趨勢，可以看出解淀粉芽孢桿菌LZN01能顯著抑制FON的孢子萌發。

2.5 解淀粉芽孢桿菌LZN01抑菌能力的穩定性試驗

由圖5可知，溫度在-20 ℃～60 ℃時，發酵上清液的抑菌活性較為穩定，抑菌率基本保持在40%左右，當溫度高于 80 ℃ 時抑菌活性快速減弱，在100、121 ℃時抑菌率僅為 4.33%、2.20%。pH值在4～9范圍內抑菌率穩定且維持在60%左右，而在此范圍內pH值為6時抑菌率為56.12%，低于其他pH值時的抑菌率。因此，解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵上清液的抑菌功能物質在pH值為4～9、-20 ℃～60 ℃溫度下生長能發揮更好的抑菌作用。

3 結論與討論

解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON具有很好的抑菌效果，對FON孢子的萌發抑制作用顯著;FON在被解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵上清液處理后，菌絲表面有嚴重受損現象;解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵產生的抑菌物質熱穩定性較好，耐酸耐堿，具有良好的應用前景。

芽孢桿菌的篩選及其抑菌功能的研究對農業生物防治極其重要[19]。筆者所在實驗室從西瓜根際分離得到一株解淀粉芽孢桿菌LZN01，對FON具有很強的抑制作用。目前，國內外的拮抗菌株對FON的抑制率較低，其中對香蕉枯萎病菌的抑制率為41%[21]，拮抗細菌對棉花枯萎病菌的抑制率為32%[22]，解淀粉芽孢桿菌HAB-7對芒果炭疽菌的抑制率為52.03%[23]，解淀粉芽孢桿菌對西瓜枯萎病的防治效果為 48.78%[24]。與前人研究結果相比，筆者所在實驗分離得到的解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON的抑菌率達57.07%，抑菌效果顯著，具有很大的開發和應用價值。

通過掃描電鏡觀察被解淀粉芽孢桿菌作用的病原真菌FON菌絲細胞發現，FON菌絲數量明顯減少，菌絲邊緣變模糊，菌絲末端膨大變形，表明解淀粉芽孢桿菌抑制了病原真菌菌絲的正常生長，與前人研究結論[15，25-27]一致。解淀粉芽孢桿菌分泌的抗菌蛋白[15]或脂肽類物質[27]在FON細胞膜上形成孔道，造成細胞內物質泄漏。導致電化學勢的喪失，細菌最終不能保持正常滲透壓[28-29]，從而導致細胞的死亡[26，30]。因此，可以推測解淀粉芽孢桿菌LZN01能夠分泌某些抗菌物質，從而達到抑制病原真菌的目的[19]。水稻根系分泌物對FON孢子萌發的抑制率可達37.8%～41.0%[31]，青霉菌、放線菌株和石灰水對FON孢子萌發抑制率為21.49%～71.97%[32]，拮抗細菌對香蕉枯萎病菌孢子萌發抑菌率為 53.3%～80.2%%[22]。本研究的解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵上清液對FON孢子懸浮液6 h抑制率為86.21%，高于已報道的生防菌株，優勢明顯。

解淀粉芽孢桿菌CMN1308隨溫度的升高抑菌效果增加[33]，而本研究溫度在-20 ℃～60 ℃時抑菌效果穩定，80 ℃ 以上抑菌率急速下降;解淀粉芽孢桿菌CMN1308只耐堿[22]，而本研究中pH值為3～10范圍內均有抑制效果，pH值在4～9范圍內抑菌率在60%左右。解淀粉芽孢桿菌LZN01發酵產生的抑菌物質熱穩定性較好，耐酸耐堿，為探索西瓜枯萎病生物防治技術和微生物制劑的開發與應用提供了理論與技術支持。

參考文獻：

[1]黃春艷，卜元卿，單正軍，等. 西瓜連作病害機理及生物防治研究進展[J]. 生態學雜志，2016，35（6）：1670-1676.

[2]于天祥，張明方. 西瓜枯萎病研究進展[J]. 中國瓜菜，2004（1）：17-19.

[3]任遷琪，吳洪生，李 季，等. 西瓜枯萎病拮抗鏈霉菌分離鑒定及盆栽抗病試驗[J]. 生物技術通報，2016，32（9）：107-113.

[4]孔慶國，于喜艷. 淺談西瓜育種成就和展望[J]. 長江蔬菜，2001（8）：26-27.

[5]鄭 琦，畢 揚，云曉敏，等. 西瓜枯萎病的研究進展及其防治[J]. 中國植保導刊，2007，27（2）：11-13.

[6]丁建成，張其安，方 凌，等. 西瓜新品種抗枯萎病鑒定[J]. 中國瓜菜，2005（6）：27-29.

[7]王 卿. 西瓜枯萎病生防細菌的篩選及作用機制初步研究[D]. 南京：南京師范大學，2013.

[8]王萬成. 關于西瓜枯萎病及其綜合防治的探討[J]. 農家之友，2008（12）：8-10.

[9]李 虎，李廣華，戴愛梅. 多抗霉素防治西瓜枯萎病藥效試驗[J]. 新疆農業科技，2016（1）：49-50.

[10]張志明，曾立紅，王漢榮. 4種藥劑防治西瓜枯萎病的效果[J]. 浙江農業科學，2016，57（12）：2063-2064.

[11]嚴蕾艷，古斌權，馬凱慧，等. 不同藥劑防治西瓜枯萎病田間藥效試驗[J]. 長江蔬菜，2016（12）：84-86.

[12]Sakata Y，Ohara T，Sugiyama M. The history and present state of the grafting of cucurbitaceous vegetables in Japan[J]. Acta Horticulturae，2007，731（731）：159-170.

[13]孫義春，苑方武，郭有泉. 棚室西瓜枯萎病發生原因與防治[J]. 北方園藝，2005（5）：91.

[14]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[15]Zhang B，Dong C J，Shang Q M，et al. New insights into membrane-active action in plasma membrane of fungal hyphae by the lipopeptide antibiotic bacillomycin L[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes，2013，1828（9）：2230-2237.

[16]Rocha F Y O，Oliveira C M D，Silva P R A D，et al. Taxonomical and functional characterization of Bacillus strains isolated from tomato plants and their biocontrol activity against races 1，2 and 3 of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici[J]. Applied Soil Ecology，2017，120：8-19.

[17]Wang P P，Guo Q G，Ma Y N，et al. DegQ regulates the production of fengycins and biofilm formation of the biocontrol agent Bacillus subtilis NCD-2[J]. Microbiological Research，2015，178：42.

[18]Khochamit N，Siripornadulsil S，Sukon P，et al. Antibacterial activity and genotypic-phenotypic characteristics of bacteriocin-producing Bacillus subtilis KKU213：potential as a probiotic strain[J]. Microbiological Research，2015，170：36.

[19]張艷群，來航線，韋小敏，等. 兩株生防芽孢細菌篩選、鑒定及拮抗研究[J]. 微生物學通報，2014，41（2）：281-289.

[20]郭志紅，李蘭珍，梁世平. 粘胞白僵菌發育過程的掃描電鏡觀察[C]//第十次全國電子顯微學會議論文集（Ⅰ）. 1998：379-380.

[21]Nel B，Steinberg C，Labuschagne N，et al. Evaluation of fungicides and sterilants for potential application in the management of Fusarium wilt of banana[J]. Crop Protection，2007，26（4）：697-705.

[22]游春平，肖愛萍，傅志岸，等. 拮抗細菌對香蕉枯萎病的防治效果[J]. 仲愷農業工程學院學報，2005，18（4）：16-20.

[23]劉文波，熊燕紅，秦春秀，等. 解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）HAB-7的培養基優化及抑菌活性[J]. 中國植保導刊，2017，37（6）：5-13.

[24]康金磊，韓 旭，張仕琦，等. 一株來源于茼蒿根際的西瓜枯萎病拮抗菌的鑒定及特性研究[J]. 華北農學報，2016，31（增刊1）：447-452.

[25]Xu H M，Rong Y J，Zhao M X，et al. Antibacterial activity of the lipopetides produced by Bacillus amyloliquefaciens M1 against multidrug-resistant Vibrio spp. isolated from diseased marine animals[J]. Applied Microbiology & Biotechnology，2014，98（1）：127.

[26]Cho J，Choi H，Lee J，et al. The antifungal activity and membrane-disruptive action of dioscin extracted from Dioscorea nipponica[J]. Biochimica Et Biophysica Acta，2013，1828（3）：1153-1158.

[27]Song B，Wang Y Z，Wang G Y，et al. The lipopeptide 6-2 produced by Bacillus amyloliquefaciens anti-CA has potent activity against the biofilm-forming organisms[J]. Marine Pollution Bulletin，2016，108（1/2）：62.

[28]楊麗莉，呂鳳霞，別小妹，等. 枯草芽孢桿菌抗菌脂肽對嗜水氣單胞菌抑菌效果[J]. 食品科學，2011，32（1）：193-198.

[29]盧春霞. 復方植物提取物對嗜水氣單胞菌抑菌作用的研究[D]. 無錫：江南大學，2011.

[30]Lee J，Hwang J S，Hwang B，et al. Influence of the papiliocin peptide derived from Papilio xuthus on the perturbation of fungal cell membranes[J]. Fems Microbiology Letters，2010，311（1）：70-75.

[31]蘇世鳴，任麗軒，楊興明，等. 西瓜專化型尖孢鐮刀菌的分離鑒定及水稻根系分泌物對其生長的影響[J]. 南京農業大學學報，2008，31（1）：57-62.

[32]王 芳，李 靜，張 歡. 青霉菌、放線菌株和石灰水對尖孢鐮刀菌抑制作用的研究[J]. 中國農學通報，2013，29（12）：185-189.

[33]張雪花，李琳玲，程 華，等. 解淀粉芽孢桿菌CMN1308抗真菌特性研究[J]. 北方園藝，2016（2）：117-121.朱彤彤，陳達川，袁夢思，等. 井岡霉素、多菌靈和不動桿菌A2混用對水稻紋枯病病菌的抑制作用[J].