小鼠經(jīng)腰段鞘內(nèi)置管的建立方法

徐靜，孫彩霞，張進(jìn)，陸培春，蔣錦，蘇兆亮

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科，江蘇 鎮(zhèn)江212001；3.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

鞘內(nèi)置管術(shù)對脊髓水平的藥理和生理機(jī)制研究必不可少，特別是在疼痛學(xué)研究中[1-2]，可以確保低劑量藥物在蛛網(wǎng)膜下腔長期慢性作用于脊髓，無需考慮藥物血腦屏障的滲透性和對其他臟器的毒性作用[3-5]。2004年WU等[6]介紹經(jīng)小鼠腰段蛛網(wǎng)膜下腔長期置管的方法，2010年翁曲瑩等[7]在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步改善、簡化置管方法，但仍存在成功率低、損傷大等缺點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)使用硬膜外導(dǎo)管和改良后的穿刺引導(dǎo)針能明顯改善上述情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及材料

60只昆明雄性小鼠，6～8周齡，由江蘇大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，按隨機(jī)數(shù)字表法分為改良組和Wu方法組，每組30只。VonFrey纖維絲（美國Stolting公司），25 μl微量注射器（鹽城市城南新區(qū)科盾辦公用品經(jīng)營部），顯微手術(shù)器械（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院），電熱恒溫水槽（上海精密儀器儀表公司），硬膜外導(dǎo)管、穿刺針（無錫市通達(dá)醫(yī)療電器有限公司），針灸針（北京珞亞山川醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 穿刺引導(dǎo)針制備改良組 ：使用的針灸針前端針身（直徑0.16 mm，長4.0 cm）與腰麻針（直徑0.23 mm，長10 cm）相接（激光焊接），制成總長約14 cm的改良穿刺針。Wu方法組：采用直徑約0.12 mm的鎢絲。見圖1。

圖1 穿刺引導(dǎo)針示意圖

1.2.2 導(dǎo)管制備取外徑 1.0 mm 的硬膜外導(dǎo)管 4 cm，均勻拉長至8 cm，外徑約0.7 mm導(dǎo)管，再將前端2 cm在熱水浴中均勻拉長至4 cm，總長為10 cm，前端長4 cm，外徑約 0.3 mm，后端長6 cm，外徑約0.7 mm，用微量注射器定容死腔容積約5 μl左右，多余部分從粗端剪去。改良組：采用翁法[7]以Parafilm膜剪成細(xì)長段纏繞導(dǎo)管，繞成3個(gè)小球以固定和定位，第1個(gè)小球距離導(dǎo)管細(xì)端約1.8～2.0 cm，在距離導(dǎo)管粗端約2.5～3.0 cm處纏繞第2個(gè)小球，距第2個(gè)小球0.3～0.5 cm最靠近導(dǎo)管粗端處纏繞第3個(gè)小球。Wu方法組：為避免管腔塌陷先將直徑0.12 mm的鎢絲穿入改良后的導(dǎo)管，分別在距導(dǎo)管粗端2.5 cm和導(dǎo)管細(xì)端2.0 cm處通過火焰迅速加熱輕壓以形成兩個(gè)直徑約1.5 mm的小球，用于固定和定位，最后抽出鎢絲備用。

1.2.3 麻醉及手術(shù)方法改良組 ：小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉75 mg/kg，麻醉后取俯臥位固定四肢，兩側(cè)髂棘連線與脊柱交界點(diǎn)定位L6棘突，以L5～L6為手術(shù)中心，沿脊柱做1個(gè)約1 cm的縱行切口，用1 ml注射器針頭（外徑0.45 mm）穿破椎體表面肌肉，進(jìn)針約2 mm即可拔出針頭，將改良的穿刺引導(dǎo)針插入已制備好的導(dǎo)管，引導(dǎo)針前端露出約1 mm針身，使針身與脊柱成20～30°角度向頭側(cè)進(jìn)針，進(jìn)針深度約4 mm左右，當(dāng)小鼠出現(xiàn)一過性甩尾或后肢抽動表示已穿破硬脊膜，將引導(dǎo)針后退約1～2 mm以免損傷脊髓，將導(dǎo)管在穿刺針的引導(dǎo)下繼續(xù)緩慢向蛛網(wǎng)膜下腔頭端置管至導(dǎo)管上第一個(gè)小球處，在小球上下用5-0慕絲線分別于椎旁肌肉結(jié)扎固定，縫合切口。在頸部做第2個(gè)切口，鈍性分離皮下組織以形成兩切口之間縱行通道，導(dǎo)管粗端通過此通道送出頸部切口，與固定第1個(gè)小球的方法相同，在皮下肌肉固定第2個(gè)小球，皮外固定第3個(gè)小球，最后縫合頸部皮膚切口時(shí)再次纏繞小球上下2次固定。熱凝封閉導(dǎo)管。Wu方法組：用相同方法麻醉固定小鼠，以脊柱L5～L6間隙為中心做1個(gè)約2 cm的縱行切口，左手抓緊骨盆髂棘處以固定及定位，右手使用23 G針頭刺破椎體表面的肌肉，內(nèi)置鎢絲的導(dǎo)管以與脊柱成20～30°的方向沿著針頭走形形成的通道置入，如突然出現(xiàn)甩尾或后肢抽動等穿破硬脊膜的特征，即將內(nèi)置的導(dǎo)絲向后退2 cm以防止鎢絲損傷脊髓，導(dǎo)管向前置到約腰膨大的位置后，將第1個(gè)小球與淺層肌肉縫合固定。在頸部做第2個(gè)切口，導(dǎo)管粗端通過兩切口之間鈍性分離出來的通道送出頸部切口，在切口處皮下肌肉固定第2個(gè)小球?？p合切口，熱凝封住導(dǎo)管末端。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 導(dǎo)管泄漏率術(shù)前在導(dǎo)管粗端連接微量注射器，推注生理鹽水，如觀察到除導(dǎo)管細(xì)端出口之外的地方有液體滲漏，則表明存在導(dǎo)管泄漏，分別統(tǒng)計(jì)兩組導(dǎo)管泄漏的數(shù)量，剔除泄漏的導(dǎo)管。

1.3.2 癱瘓率與死亡率置管后第 1 天，分別統(tǒng)計(jì)兩組小鼠術(shù)后單側(cè)或雙側(cè)癱瘓和死亡只數(shù)，計(jì)算癱瘓率和死亡率。挑選出陰性的小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 置管成功率使用微量注射器依次抽取生理鹽水 5 μl，空氣 1 μl，2% 利多卡因 5 μl，計(jì) 11 μl全部通過導(dǎo)管注入，以使5 μl的藥物能全部推入鞘內(nèi)。若給藥后10～15 s內(nèi)小鼠出現(xiàn)持續(xù)10～12 min的下肢癱瘓即為置管成功。計(jì)算兩組小鼠置管成功的只數(shù)，計(jì)算成功率。選擇成功的小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 熱甩尾潛伏期

在置管前至置管后7 d，每天分別將兩組小鼠尾端1/3置入48℃恒溫?zé)崴≈校涗浶∈蟪霈F(xiàn)甩動尾巴或縮出水面的時(shí)間，浸于水中時(shí)間最大不超過15 s以防止?fàn)C傷。每只小鼠測3次取其平均值，每次間隔時(shí)間為10 min，記錄小鼠的熱甩尾潛伏期（the tailflick latency,TFL）。

1.5 50%機(jī)械縮足反應(yīng)閾值

在置管前至置管后7 d，在安靜環(huán)境下，采用Up and Down法[8]將VonFrey纖毛垂直刺激小鼠足底皮膚，每次刺激間隔至少30 s，纖毛最大折力為2.0 g，超過此值時(shí)記為2.0 g，根據(jù)刺激的纖毛力度及小鼠的縮足反射推算50%機(jī)械縮足反應(yīng)閾值（mechanical withdrawal threshold,MWT）。

1.6 脊髓形態(tài)和導(dǎo)管位置

在結(jié)束所有行為學(xué)檢查之后，將1% 亞甲藍(lán)5 μl注入導(dǎo)管后處死小鼠，切開腰段皮膚觀察導(dǎo)管所在位置有無滑脫，統(tǒng)計(jì)各組的導(dǎo)管滑脫率，分離取腰段脊髓，在顯微鏡下觀察脊髓形態(tài)和導(dǎo)管位置。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，多時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 置管后兩組觀察指標(biāo)的比較

改良組與Wu方法組比較，導(dǎo)管泄漏率和術(shù)后癱瘓率減少（P＜0.05），死亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。改良組置管成功率與Wu方法組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），改良組增加。兩組小鼠顯微鏡下脊髓形態(tài)無差異，改良組導(dǎo)管滑脫率與Wu方法組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），改良組下降。見表1。

2.2 TFL比較

改良組與Wu方法組小鼠在置管前至置管后7d內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)TFL值的比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的TFL值無差異（F=2.741，P=0.103）；②兩組的 TFL值無差異（F=7.165，P=0.055）；③兩組的TFL值隨時(shí)間變化趨勢無差異（F=0.258，P=0.826）。見圖2 和表2。

表1 置管后兩組觀察指標(biāo)的比較 （n =30，%）

2.3 50% MWT比較

圖2 小鼠置管前至置管后7 d甩尾反應(yīng)變化趨勢（n =30，±s）

表2 兩組各時(shí)間點(diǎn)的 TFL 比較 （n =30，±s）

表2 兩組各時(shí)間點(diǎn)的 TFL 比較 （n =30，±s）

組別 置管前 置管后第1天 置管后第2天 置管后第3天 置管后第4天 置管后第5天 置管后第6天 置管后第7天改良組 4.74±0.02 4.77±0.04 4.78±0.04 4.82±0.05 4.80±0.03 4.78±0.03 4.77±0.03 4.79±0.01 Wu 方法組 4.75±0.02 4.79±0.04 4.82±0.03 4.83±0.03 4.82±0.03 4.81±0.03 4.80±0.05 4.82±0.04

改良組與Wu方法組小鼠在置管前至置管后7d內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)50% MWT比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的50% MWT值無差異（F=1.506，P=0.206）。②兩組的 50% MWT 值無差異（F=5.449，P=0.080）。③兩組的 50% MWT 值隨時(shí)間變化趨勢無差異（F=0.114，P=0.997）。見表3 和圖3。

表3 兩組各時(shí)間點(diǎn)的 50% MWT 比較 （n =30，±s）

表3 兩組各時(shí)間點(diǎn)的 50% MWT 比較 （n =30，±s）

組別 置管前 置管后第1天 置管后第2天 置管后第3天 置管后第4天 置管后第5天 置管后第6天 置管后第7天改良組 1.50±0.03 1.48±0.02 1.48±0.03 1.47±0.02 1.48±0.03 1.49±0.02 1.50±0.02 1.51±0.02 Wu 方法組 1.51±0.02 1.50±0.02 1.50±0.01 1.49±0.03 1.49±0.02 1.50±0.03 1.51±0.03 1.52±0.03

圖3 小鼠置管前至置管后7 d 50% MWT變化趨勢（n =30，±s）

3 討論

鞘內(nèi)置管技術(shù)為動物實(shí)驗(yàn)長期鞘內(nèi)給藥和采集腦脊液提供極大的便利。目前鞘內(nèi)給藥方式有蛛網(wǎng)膜下腔穿刺和鞘內(nèi)置管兩種，蛛網(wǎng)膜下腔穿刺有便利快捷、簡便易行等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，但其有明顯的局限性：①穿刺過程中可出現(xiàn)脊髓、神經(jīng)損傷，不適用于反復(fù)持續(xù)給藥觀察的研究。②無法僅憑手感判斷注射成功。③給藥過程需要制動老鼠導(dǎo)致急性應(yīng)激反應(yīng)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11-12]。而鞘內(nèi)置管可以長期給藥，且保證藥物注射至鞘內(nèi)，但眾多模型表示置管仍有操作復(fù)雜、置管失敗、腦脊液漏、脊髓損傷、導(dǎo)管脫落等并發(fā)癥[13]，因此探討簡單、安全、方便的鞘內(nèi)置管技術(shù)至關(guān)重要。

本研究過程中發(fā)現(xiàn)Wu法存在以下幾點(diǎn)不足：①PE10導(dǎo)管拉伸性欠佳，極易容易拉斷，影響后續(xù)操作；②PE導(dǎo)管采用火焰快速加熱后壓迫形成固定定位用的小球，卻容易在此過程中損傷導(dǎo)管造成泄漏，另由于小球過小，固定處容易滑脫進(jìn)而造成導(dǎo)管滑脫移位；③鎢絲細(xì)軟，使用鎢絲作為內(nèi)置導(dǎo)絲，在穿過脊柱周圍組織時(shí)受壓而變形彎曲，另難以穿破堅(jiān)韌的椎間韌帶和硬脊膜，置入受阻以致置管失敗。針對上述情況，本研究作了相對的改善：①導(dǎo)管使用硬膜外導(dǎo)管，雖初始直徑較PE10粗，但其拉伸延展性極好，能達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需直徑，且不易拉斷。②導(dǎo)管采用Parafilm封口膜纏繞可固定成所需體積的小球，且在頸部切口處有兩個(gè)小球，分別與切口內(nèi)外肌肉縫合固定，即可防止導(dǎo)管被小鼠拔除，又可防止導(dǎo)管回縮至皮下。③采用中醫(yī)針灸針直徑0.16 mm，因其只有4 cm長，故后端與直徑0.23 mm的腰麻針連接，前端有針尖，能同時(shí)保證導(dǎo)絲的硬度和前端尖銳，極大程度地減少穿破椎間韌帶和硬脊膜的阻力，同時(shí)減少導(dǎo)絲彎曲變形的概率。但需注意出現(xiàn)穿破硬脊膜的征象后要立即后退導(dǎo)絲，防止損傷脊髓。

研究中改良組仍有較低的術(shù)后癱瘓率及死亡率，可能在刺破硬膜后沒有及時(shí)撤回穿刺導(dǎo)絲而損傷到脊髓有關(guān)，在操作熟練后能進(jìn)一步避免。另本研究最主要的改良點(diǎn)在于使用硬膜外導(dǎo)管、針灸針、腰椎穿刺針，這些材料易得，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用改良的導(dǎo)管及導(dǎo)管固定方法可以明顯降低導(dǎo)管泄漏率、導(dǎo)管滑脫率，而改裝的穿引導(dǎo)絲前端的針尖能減少穿刺阻力，增加導(dǎo)絲韌度。改良組較Wu方法組可明顯提高置管成功率，降低術(shù)后并發(fā)癥。綜上所述，建立鞘內(nèi)置管模型的方法是行之有效的。