Angiopep-2修飾脂質(zhì)體的構(gòu)建及其腦靶向性研究

李培育，吳成吉

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002）

根據(jù)WHO相關(guān)文件公布的數(shù)據(jù)顯示，全世界約25%人群患有程度不一的中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病，而且每年患病例數(shù)都在快速增長，據(jù)保守估計(jì)到2020年，此發(fā)病例數(shù)會增加至19億之多[1]。其中由中樞神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)的腦部腫瘤、癲癇疾病、神經(jīng)退行性疾病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響人類的正常生活。目前對此類疾病的治療辦法不多，且多受限于血腦屏障的阻礙，療效難以發(fā)揮，使得腦部疾病治療藥物很難到達(dá)病變組織，因此，開發(fā)具有腦部靶向性的給藥系統(tǒng)成為了當(dāng)前中樞神經(jīng)疾病治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2-4]。有研究表明，Angiopep-2可通過二巰基丙醇（dimercaprol dimercaptopropanol,BBB）上低密度脂蛋白受體及其表達(dá)的相關(guān)蛋白（LRP）受體，將藥物介導(dǎo)并以內(nèi)吞的方式進(jìn)入腦組織，是一種潛在的腦靶向給藥載體[5]。本研究將Angiopep-2連接到脂質(zhì)體的表面，研究其腦靶向性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

激光粒度測定儀及配套的Zeta電位測試儀（英國馬爾文公司，型號：Sizer Nano ZS90 型），Angiopep-2（安徽安科生物工程有限公司），大豆卵磷脂（美國Sigma公司），DSPE-PEG2000（美國DOW公司），香豆素-6（美國Sigma公司），DSPE-PEG2000-MAL（美國DOW公司）。實(shí)驗(yàn)大鼠購置于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，Wistar大鼠體重 200 ～ 300 g。

1.2 方法

1.2.1 Angiopep-2（AP-LP）的制備根據(jù)文獻(xiàn) [6-7]方法首先合成AP-PEG2000-DSPE。具體方法：先稱取大豆磷脂 22.50mg、膽固醇 1.88mg、DSPE-PEG2000 1.75mg、AP-PEG2000-DSPE 1.20mg及其他實(shí)驗(yàn)材料，模型藥物溶解在有機(jī)溶劑氯仿中，采用化學(xué)中的減壓蒸餾法操作并使其成膜，然后將有機(jī)溶劑去除干凈，將此成膜材料置于干燥器中干燥，干燥結(jié)束后，加入2ml PBS水化得到AP-LP。取脂質(zhì)體適量，用馬爾文激光粒度儀測量其粒徑及電位。

1.2.2 體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn) [8-9]方法原代培養(yǎng)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain capillary endothelium cell,BCEC）。取 10只 7～ 10 d的 SD 大鼠，斷頸處死后置碘伏中消毒，于無菌培養(yǎng)皿中75%酒精脫碘，取出的全腦組織裝入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中，包括小腦組織、間腦組織（包括海馬）、大腦白質(zhì)、殘余大血管。將大腦半球在潤濕的濾紙上緩慢滾動以吸除軟腦膜及大血管。將大腦皮質(zhì)經(jīng)緩沖液漂洗后，剪碎成 1mm×1mm×1mm 大小，加入 0.1% CollagenaseⅡ溶液10ml混勻后37℃水浴緩慢振搖消化1h，室溫下 1500r/min 離心 10min，棄上清液，于沉淀中加入25% BSA 溶液混勻，低溫 3000r/min 離心 15min，去除中上層神經(jīng)組織及大血管，用緩沖液輕輕漂洗，底部沉淀加入 2ml 0.1% CollagenaseⅡ溶液吹打混勻后于37℃水浴緩慢振搖消化 30min，室溫下 1500r/min 離心 10min，棄上清液，加入 2ml DMEM 培養(yǎng)液懸浮。50% Percoll經(jīng) 15000r/min 梯度離心形成連續(xù)梯度后，將懸浮液鋪于頁面，4℃、2000r/min 離心 10min，距離梯度液面4/5處的紅細(xì)胞層之上白黃色的層面即為純化的微血管段，漂洗1次，加入BCEC的培養(yǎng)液懸浮于接種于涂布1%明膠的35mm的表面皿中，加入37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

將培養(yǎng)的生長期細(xì)胞接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)24h后，在孔板的每個孔中加入相應(yīng)的不同種類的脂質(zhì)體，其濃度均為 0.25mg/ml，37℃時(shí)孵育 2 和 4h 后，除去含脂質(zhì)體培養(yǎng)基，然后溫度較低的PBS洗滌2次，采用濃度為0.25%胰酶處理后進(jìn)行離心操作，緩沖液洗滌2、3次后，檢測細(xì)胞熒光響應(yīng)值。細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取率的測定步驟是將細(xì)胞漂洗3次后，加入DAPI溶液，濃度為 2μg/ml，培育時(shí)間設(shè)置為 15min。加4% 甲醛多聚物溶液固定，低溫磷酸鹽緩沖液保存，顯微鏡觀察細(xì)胞對脂質(zhì)體攝取數(shù)。

1.2.3 脂質(zhì)體膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究按 2×105個 /cm2的速率濃度將BCEC接種于在聚碳酸脂膜上，進(jìn)行3周培育，然后以細(xì)胞跨膜電阻儀進(jìn)行細(xì)胞電阻的測定，當(dāng)電阻值＞250 Ω/cm2時(shí)，則可進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究。此時(shí)上腔A面加入現(xiàn)配的脂質(zhì)體溶液，下腔B面加入等濃度的PBS。定時(shí)取出下腔B面溶液，用熒光分光光度法測定其熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)和重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，兩組比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的表征

AP-LP粒徑 為（125±15.5）nm，Zeta電位為（8.35±3.64）mV。

2.2 大鼠的BCEC形態(tài)

原代培養(yǎng)后的BCEC，在光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，成長7 d后呈現(xiàn)明顯的鋪路石狀態(tài)。見圖1。

2.3 脂質(zhì)體的攝取率

AP-LP的攝取率在4 h是2 h的1.7倍，2個時(shí)間點(diǎn)攝取率的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。BCEC對AP-LP的攝取效率是普通脂質(zhì)體的4.1倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。共聚焦觀察顯示，AP-LP的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于其他組（見圖2）。

2.4 AP-LP穿透血腦屏障能力的比較

AP-LP組與LP組在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 h不同時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度的比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度有差異（F=23.387，P=0.000）；②AP-LP組與LP組熒光強(qiáng)度有差異（F=10.643，P=0.000），AP-LP 熒光強(qiáng)度高于對照組；③AP-LP組與LP組熒光強(qiáng)度變化趨勢有差異（F=13.442，P=0.000）。見表2 和圖3。

圖1 培養(yǎng)第7天時(shí)的BCEC形態(tài) （×400）

表1 BCEC對不同脂質(zhì)體的攝取率比較（n =3，%，±s）

表1 BCEC對不同脂質(zhì)體的攝取率比較（n =3，%，±s）

組別 2 h 4 h t值 P值LP組 28.35±2.55 42.58±3.60 5.585 0.003 AP-LP組 101.27±6.62 172.32±7.50 12.475 0.000 t值 17.804 27.220 - -P值 0.000 0.000 - -

圖2 共聚焦觀察BCEC對香豆素-6脂質(zhì)體的攝取 （×400）

表2 AP-LP穿透血腦屏障的能力比較 （n =3，±s）

表2 AP-LP穿透血腦屏障的能力比較 （n =3，±s）

組別 0.5 h 1.0 h 2.0 h 3.0 h 4.0 h 6.0 h 8.0 h 10.0 h 12.0 h LP 組 2.12±0.98 4.31±1.89 9.12±3.30 13.76±4.87 18.78±5.12 22.71±5.78 25.21±6.12 29.45±6.43 36.42±7.42 AP-LP 組 2.31±1.01 5.17±2.38 11.11±4.39 26.11±5.90 35.23±6.31 47.45±6.87 61.23±8.31 83.12±7.23 115.34±8.31

圖3 兩組熒光強(qiáng)度變化趨勢 （n =3）

3 討論

血腦屏障一方面可以保護(hù)腦部組織不受侵害，另一方面也制約了藥物向腦部組織的傳遞，使得藥物的療效降低。目前隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的復(fù)雜性和多邊形的特點(diǎn)，人們對促進(jìn)藥物透過血腦屏障的新策略的需求日益迫切[10-12]。非侵襲性給藥途徑因其安全性及順應(yīng)性好等優(yōu)勢，成為藥物腦內(nèi)遞送的研究重點(diǎn)[13]。本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種具有腦部遞藥能力的脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)。將Angiopep-2連接到脂質(zhì)體表面，并且以BBB表達(dá)的LDL受體以及其LRP進(jìn)行跨越血腦屏障的嘗試。

本項(xiàng)研究以原代培養(yǎng)血腦屏障的主要功能性大鼠BCEC，并通過研究BCEC對Angiopep-2修飾的脂質(zhì)體的攝取，結(jié)果顯示，藥物脂質(zhì)體在以Angiopep-2進(jìn)行修飾后，可降低BCEC對脂質(zhì)體的攝取。實(shí)驗(yàn)結(jié)表明，Angiopep-2修飾的脂質(zhì)體組的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于普通脂質(zhì)體，這與定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。BCEC吸收攝取脂質(zhì)體的數(shù)量還存在不足，不能完全模擬脂質(zhì)體跨血腦屏障能力，為研究BCBE對修飾后的脂質(zhì)體攝入透過血腦屏障的數(shù)量大小，有研究嘗試構(gòu)建體外培育的BBB細(xì)胞模型，通過該模型進(jìn)行血腦屏障的模擬性試驗(yàn)，并以此探究患者的生理功能，同時(shí)還連接腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，得出藥物脂質(zhì)體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。結(jié)果顯示，脂質(zhì)體經(jīng)過Angiopep-2修飾后，跨膜能力顯著增強(qiáng)。

綜上所述，本研究構(gòu)建的Angiopep-2修飾的脂質(zhì)體與BCEC具有良好的親和力，能夠有效跨越血腦屏障，是一種潛在高效的腦部遞藥系統(tǒng)。