高劑量D-半乳糖復制C57BL/6J 衰老小鼠模型的研究

趙煥東，胥洪鵑，李堅，任彩萍，陳玉祥

（1.中南大學湘雅醫院 手術室，湖南 長沙 410008；2.中南大學基礎醫學院 腫瘤研究所，湖南 長沙 410078；3.中南大學湘雅醫院 普外科，湖南 長沙 410008； 4.中南大學湘雅藥學院，湖南 長沙 410013）

隨著醫療水平不斷提高，人口老齡化已成為當今亟需解決的問題。近年來，衰老機制與抗衰老的研究備受關注[1]。眾所周知，衰老是一個與氧化應激密切相關而又復雜的過程，不僅會導致機體形態學改變，而且會影響心、腦、肺等器官的功能[2-3]。為提高人們生活質量并有效延緩衰老，抗氧化和衰老藥物或食品的研究成為熱點。動物衰老模型的復制是衰老相關研究中必然涉及到的內容，選擇合適的衰老模型極為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-半乳糖（美國Sigma公司），水合氯醛（北京索萊寶科技有限公司），聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate, BCA）試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）試劑盒及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，組織裂解液、苯甲基磺酰氟購自上海碧云天生物技術有限公司，抗血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）抗體（美國Abcam公司），抗β-actin抗體（美國CST公司），辣根過氧化物酶標記二抗（杭州聯科生物技術股份有限公司），增強型化學發光液（Electrochemiluminescence, ECL）（蘇州新賽美生物技術公司）。

1.2 主要儀器

電泳儀（美國Bio-Rad公司），全波長酶標儀（美國BioTek公司），化學發光、可見光成像系統購自美國ProteinSimple公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物與分組9周齡C57BL/6J小鼠30只，體重（20±2）g，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，許可證號：SYXK（湘）2015-0017。小鼠飼養環境由中南大學實驗動物學部提供，SPF級，溫度25℃，相對濕度60%，12 h晝/夜循環照明，自由進食、飲水。小鼠適應性飼養1周后，隨機分為3組：500 mg/（kg·d）D-半乳糖組、1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組及對照組。每組10只，每組分2籠飼養，每籠5只。500和1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠分別經頸背部皮下注射500和1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖，對照組小鼠按體重經頸背部注射0.9%生理鹽水1次/d，持續8周。本研究所用動物實驗方法通過中南大學實驗動物學系的審批。

1.3.2 SOD、GSH-Px、MDA的檢測給藥結束后，小鼠禁食24 h，經水合氯醛麻醉，摘眼球取血，室溫靜置1 h，4℃、12 000 r/min離心分離血清，保存于-20℃。同時取肝、腦組織保存于-80℃備用。嚴格按試劑盒說明書進行操作，測定血清SOD、GSH-Px及MDA。制備肝臟和腦組織勻漿液，4℃、12 000 r/min離心，測定SOD、GSH-PX活性和MDA含量。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色解剖小鼠時取部分肝臟和腦組織于10%甲醛浸泡，脫水后石蠟包埋，切片，行HE染色，樣品掃描后用Case Viewer軟件 分析。

1.3.4 Western blotting制備肝臟和腦組織勻漿液，4℃、12 000 r/min離心，取上清。采用BCA法測定蛋白濃度，行SDS-PAGE凝膠電泳，將電泳后的蛋白轉至PVDF膜上，用5%牛血清蛋白TBST溶液室溫封閉1 h，相繼孵育一抗（抗HO-1和抗β-actin）和二抗。采用ECL發光顯色，AlphaView軟件進行條帶分析。

1.4 統計學方法

數據處理分析采用SPSS 18.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高劑量D-半乳糖誘導C57BL/6J小鼠發生形態學改變

3組小鼠初始體重比較，經方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）；3組小鼠末次體重比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；且3組體重增值均＞7 g（見表1）。小鼠在形態表現上也有較大差異，從第6周開始，1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠頭頸部陸續發生不同程度的脫毛現象，且隨著干預時間延長，D-半乳糖組小鼠毛色逐漸泛黃，出現精神萎靡、皮膚彈性變差等（見圖1）。

表1 3組小鼠藥物干預第1天和最后1天的體重比較（n =10，g，±s）

表1 3組小鼠藥物干預第1天和最后1天的體重比較（n =10，g，±s）

組別第1天最后1天對照組24.660±0.68030.600±0.758 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組24.700±0.57028.000±0.224 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組24.580±0.61825.240±0.483 F值0.480125.604 P值0.9530.000

2.2 3組小鼠血清、肝臟和腦組織生化指標比較

2.2.1 SOD活性3組小鼠血清、肝臟和腦組織SOD活性比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，500 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠腦組織SOD活性低于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織SOD活性低于對照組（P＜0.05）。

圖1 3組小鼠外觀形態變化

2.2.2 GSH-Px活性3組小鼠血清、肝臟和腦組織GSH-Px活性比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗， 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織GSH-Px活性低于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織GSH-Px活性低于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠肝臟GSH-Px活性低于500 mg/（kg·d）D-半乳糖組（P＜0.05）。

2.2.3 MDA含量3組小鼠血清、肝臟和腦組織MDA含量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，500 mg/（kg·d） D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織MDA含量高于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織MDA含量高于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清和肝臟MDA含量高于500 mg/（kg·d）D-半乳糖組（P＜0.05）。見表2～4和圖2。

2.3 肝臟和腦組織HE染色結果

對照組肝組織切片顯示細胞核大且圓，肝索排列整齊，細胞無變性或者壞死，D-半乳糖處理后肝細胞出現點狀壞死、水腫和空泡樣變性，并且出現淋巴細胞浸潤，肝索排列排混亂（見圖3A～C）。從腦組織海馬區齒狀回切片可以觀察到，與對照組比較，D-半乳糖處理過的小鼠腦顆粒細胞排列混亂，細胞形狀變小，細胞核形狀改變，發生固縮，且核深染（見圖3D～F）。

表2 3組小鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

表2 3組小鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

組別SOD/（u/ml）GSH-Px/（u/ml）MDA/（nmol/ml）對照組198.85±9.96301.58±18.285.79±0.57 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組177.81±11.83272.53±16.438.07±1.15 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組166.00±13.93260.00±26.2610.06±1.02 F值7.1435.37927.496 P值0.0080.0200.000

表3 3組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

表3 3組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

組別SOD/（u/mg）GSH-Px/（u/mg）MDA/（nmol/mg）對照組92.84±5.811 015.56±47.450.77±0.03 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組87.23±2.03820.07±41.811.12±0.03 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組78.69±4.29687.13±28.631.83±0.07 F值14.97195.454677.962 P值0.0000.0000.000

表4 3組小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

表4 3組小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

組別SOD/（u/mg）GSH-Px/（u/mg）MDA/（nmol/mg）對照組196.32±12.1439.83±6.341.70±0.35 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組170.54±17.6130.80±4.782.33±0.54 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組164.71±20.3027.34±6.682.76±0.44 F值4.9686.0537.669 P值0.0250.0140.006

圖2 3組小鼠血清、肝、腦組織生化指標比較（n =10，±s）

圖3 小鼠肝臟和腦組織病理切片圖（HE染色）

2.4 肝臟和腦組織HO-1蛋白的表達

3組大鼠肝臟HO-1蛋白表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，500 mg/（kg·d）D-半乳糖組肝HO-1表達水平高于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半 乳糖組肝HO-1表達水平高于500 mg/（kg·d）D-半乳糖組（P＜0.05）。3組大鼠腦組織HO-1蛋白表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，500 mg/（kg·d）D-半 乳糖組腦HO-1表達水平高于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組腦HO-1表達水平高于500 mg/（kg·d）D-半乳糖組（P＜0.05）。見表5和圖4。

表5 3組小鼠肝臟和腦組織HO-1蛋白表達水平比較（n =10，±s）

表5 3組小鼠肝臟和腦組織HO-1蛋白表達水平比較（n =10，±s）

組別肝臟腦組織對照組1.00±0.001.00±0.00 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組1.22±0.031.41±0.09 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組1.48±0.091.82±0.10 F值161.525104.939 P值0.0000.000

圖4 小鼠肝臟和腦組織HO-1的表達

3 討論

以往研究對于動物衰老模型的選擇包括以下 5種：①自然衰老小鼠；②快速衰老小鼠SAMP8[4]；③胸腺切除小鼠[5]；④γ射線輻射衰老小鼠模型[6]；⑤D-半乳糖誘導的衰老小鼠模型。其中D-半乳糖法復制衰老小鼠模型由我國學者龔國清等[7]在1991年 提出，因其操作簡便、成本低廉和周期短等優點，受到眾多科研工作者青睞。不同文獻報道中使用的D-半乳糖劑量并不一致，最低為50 mg/（kg·d）[8]，而最高可達1 250 mg/（kg·d）[9]，但多數研究劑量為120～200 mg/（kg·d）[10-11]，小鼠品種多為ICR和昆明種。目前未見關于D-半乳糖處理的小鼠是否會發生明顯形態學改變的報道。C57BL/6J近交系小鼠相比ICR和昆明小鼠具有個體差異小、生長速率慢的特點，用于多種領域的研究[12-13]。關于D-半乳糖誘導衰老的機制仍不明確，目前有2種猜想：一種認為在半乳糖氧化酶的催化下，D-半乳糖反應產生醛糖和過氧化氫，導致ROS增加和超氧自由基大量累積，使機體受到損傷，發生衰老[14]；另一種觀點認為，在醛糖還原作用下，體內高濃度D-半乳糖被還原為半乳糖醇，不能發生進一步代謝而在細胞內累積，影響到滲透壓，繼而導致細胞發生腫脹和功能障礙[15]。本研究采用高濃度D-半乳糖 500 mg/（kg·d）和1 000 mg/（kg·d）誘導小鼠衰老模型，研究其對小鼠體內氧化應激相關指標的影響及對小鼠外觀形態上的改變。

結本研究果發現，3組藥物干預初始體重體重無顯著性差異，而末次體重D-半乳糖組較對照組低，說明D-半乳糖對小鼠體重有一定影響。此外，本研究中，3組初次和末次體重增值均＞7 g，而其他研究中ICR和昆明小鼠8周內體重增值均＜10 g[16-17]，說明C57BL/6J個體差異相對較小，生長速率慢，體重對后續檢測指標影響小，有利于提高檢測結果的可比性。1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖處理8周后的小鼠頭頸部出現脫毛現象，而其他部位沒有，該癥狀通常與干細胞、細胞凋亡、氧化應激及黑色素含量喪失密切相關，與人體衰老特征相似[18-19]，但這種脫毛以1個部位為中心的現象也類似斑禿，這是一種慢性炎癥自身免疫性疾病，以無疤痕脫發為主要表現[20]。研究發現，斑禿與許多因素相關，其中就包括氧化應激[21]。但D-半乳糖是否會誘導出現斑禿并沒有報道，還有待進一步研究。

SOD、GSH-Px活性和MDA含量與氧化應激和衰老密切相關[22-23]。其中，SOD與GSH-Px具有很強的清除自由基能力，是機體重要的抗氧化酶，MDA含量能反映脂質過氧化的程度及自由基對組織和細胞的攻擊作用[24]。結果顯示，D-半乳糖處理過后對以上指標都產生影響，盡管500和1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組并不是所有指標都有差異，但從趨勢上看1000 mg/（kg·d）D-半乳糖組對以上指標影響更大。

衰老在細胞層面常常表現出細胞體積縮小，水分減少、核變形固縮、異常分葉、染色加深等病理學改變[25]。本研究結果發現，小鼠肝小葉細胞出現水腫、點狀壞死等病理學改變，這與炎癥密切相關，提示D-半乳糖誘導的衰老模型可能同時伴隨著組織炎癥反應，腦海馬區齒狀回顆粒細胞核深染固縮，這與細胞衰老所表現出的現象一致。

HO-1是血紅素加氧酶中的誘導型酶，近年來發現其廣泛參與體內抗炎與抗氧化過程，機體在正常情況下，HO-1的表達水平很低，但出現氧化應激時，作為應激蛋白HO-1表達水平會明顯升高以抑制損傷的發生[26-27]。目前小鼠衰老模型的主要檢測指標仍為生化指標，尚無檢測HO-1的報道，本研究顯示，D-半乳糖組小鼠肝臟和腦組織中HO-1表達水平高于對照組，證實HO-1與小鼠衰老密切相關。1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組HO-1表達水平比500 mg/（kg·d）D-半 乳糖組更高，這與生化檢測結果趨勢基本一致。

D-半乳糖誘導的小鼠衰老模型是一種簡便的氧化應激和抗氧化、抗衰老的研究方法。雖然目前仍存在爭議，但是已廣泛應用到氧化應激相關研究中。本研究選用高劑量D-半乳糖誘導個體差異較小的近交系小鼠C57BL/6J，成功地復制一種可用于氧化應激和抗氧化、抗衰老研究的衰老模型。