老年大鼠大腦中動脈永久性缺血與缺血再灌注 對大腦損傷的比較研究

許娜，渠靜，王賽楠，江煒，奧婷，張君，張芹，肖淑英，張瑞華

（首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院 1.老年醫(yī)學科，2.中美神經(jīng)研究所，北京 101149）

缺血性腦卒中是中老年人易患的三大疾病之一，呈高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的趨勢，給社會和家庭帶來沉重負擔。腦缺血發(fā)病后出現(xiàn)缺血再灌注（ischemia reperfusion, IR）的相關(guān)問題，既可以改善腦組織的血液供應(yīng)，恢復(fù)神經(jīng)功能，又可導(dǎo)致?lián)p傷[1]。目前腦I/R帶來保護或損傷的機制尚不清晰，炎癥和氧化反應(yīng)可能是重要的因素[2-4]。本研究采用大鼠中腦動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）的方法復(fù)制動物模型，觀察老年大鼠大腦I/R后腦梗死相關(guān)指標的改變[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性老年SD大鼠（北京維通利華公司提供）30只，體重520～550 g，術(shù)前1周適應(yīng)環(huán)境。將大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、永久性缺血組 （I組）和缺血再灌注組（I/R組），每組10只。I/R組插入線栓2 h后拔出，I組僅插入線栓不拔出，Sham組在麻醉后僅分離動脈。

1.2 實驗試劑及儀器

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）（北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司），硅膠線栓（北京西濃科技有限公司），高遷移率族蛋白-1（high mobility group protein 1, HMGB1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）ELISA試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），HMGB1單克隆抗體（美國Abcam公司），β-actin多克隆抗體（北京冠星宇科技有限公司）。

1.3 動物模型的復(fù)制

將老年大鼠置入麻醉機誘導(dǎo)箱內(nèi)全身麻醉2～3 min，置于手術(shù)臺改用呼吸導(dǎo)管維持麻醉，大鼠全身肌肉松弛，仰臥固定，剃去頸前區(qū)毛發(fā)，消毒手術(shù)區(qū)域皮膚，行頸正中切口，鈍性分離皮下組織，用自制拉鉤分離大鼠右側(cè)乳突肌與胸骨舌肌之間的肌間隙，暴露頸總動脈，鈍性分離頸總動脈與周圍組織，顯微鑷挑出頸總動脈穿線備用。鈍性分離頸內(nèi)外動脈后，電凝頸外動脈小分支，于距頸總動脈3～4 mm處結(jié)扎頸外動脈并電凝離斷，在游離血管殘端與頸總動脈間打一活結(jié)。動脈夾夾閉頸總動脈及頸內(nèi)動脈，在頸外動脈殘端剪一小口，將硅膠線栓沿頸內(nèi)動脈的夾角外切口插入，將頸外動脈殘端拉向外上方，使之與頸內(nèi)動脈走向平行，將線栓沿頸內(nèi)動脈走向輕柔緩慢推進，當感覺到有阻力時，提示線栓進入大腦中 動脈[5-6]。

1.4 腦血流檢測

老年SD大鼠經(jīng)異氟烷誘導(dǎo)并維持麻醉，俯臥位固定，沿頭皮正中切開，用雙氧水去除骨膜及顱骨表面的脂類，充分暴露顱骨和前囟。在前囟后2 mm、右側(cè)旁開5 mm處，用小型顱骨鉆將顱骨磨薄（不能鉆透）。用激光多普勒儀（瑞典PeriFlux5000系統(tǒng)）監(jiān)測血流。

1.5 腦梗死體積測量

術(shù)后24 h麻醉大鼠，快速斷頭取腦組織，將腦組織切片置于2% TTC溶液中染色[7]?？梢姽Ｋ涝顓^(qū)呈白色，正常組織呈紅色，部分組織由白色向紅色過渡。用Image J 1.42加以分析（NIH圖像分析軟件）。

1.6 腦組織HMGB1、MDA含量及SOD活性檢測

各組大鼠處死后去腦組織，提取蛋白，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，使用酶聯(lián)儀于450 nm波長處測吸光度值，通過繪制標準曲線求出標本中的HMGB1、MDA及SOD質(zhì)量濃度。

1.7 Western blotting檢測腦組織HMGB1蛋白的表達

大鼠處死后取腦組織，置于冰上研磨，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度。取10μg蛋白進行凝膠電泳。當電泳完成后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入單克隆抗體HMGB1（1∶10 000稀釋）室溫孵育2 h。TBST洗滌后，加入二抗室溫孵育1 h。TBST洗滌，電化學發(fā)光試劑顯色。β-actin作為內(nèi)參，使用LabWork 4.0圖像分析軟件進行檢測。每份樣品檢測3次，取其平均值。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠腦血流比較

3組大鼠術(shù)后0、2、6、12及24 h的腦血流量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果如下：①不同時間點的腦血流量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=18.267，P=0.000）；②3組的腦血流量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=103.912，P=0.000）；③各組腦血流量變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=19.183，P=0.000）。見表1和圖1。

表1 3組大鼠不同時間點腦血流量比較（n =10，ml/min，±s）

表1 3組大鼠不同時間點腦血流量比較（n =10，ml/min，±s）

組別0 h2 h6 h12 h24 h Sham組233.6±2.991235.5±2.500230.7±2.371234.5±1.918235.7±1.658 I組234.1±3.515111.5±2.25576.39±3.65748.75±1.25065.34±2.178 I/R組235.0±2.699110.8±2.175123.8±3.018 142.3±2.097154.3±1.918

圖1 3組大鼠腦血流量變化趨勢（n =10，±s）

圖2 3組大鼠腦梗死體積比較（n =10，±s）

2.2 3組大鼠腦梗死體積比較

Sham組、I組及I/R組大鼠腦梗死體積百分比分別為（6.673±1.690）%、（33.523±6.112）%和（20.167±4.733）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=38.83，P=0.000）。與Sham組相比，I組升高（P＜0.05）；與I組相比，I/R組降低（P＜0.05）。見圖2。

2.3 3組大鼠腦組織SOD活性及MDA、HMGB1含量比較

Sham組、I組及I/R組大鼠腦組織SOD活性分別為（468.974±34.429）、（310.247±49.118）和（388.971±63.496）pg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=15.410，P=0.000）；與Sham組相比，I組降低（P＜0.05），與I組相比，I/R組升高（P＜0.05）。Sham組、I組及I/R組大鼠腦組織MDA含量分別為（103.009±44.517）、（228.558±41.504）和（163.879± 35.709）pg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F= 14.780，P=0.000）；與Sham組相比，I組升高（P＜0.05），與I組相比，I/R組降低（P＜0.05）。Sham組、I組及I/R組大鼠腦組織HMGB1含量分別為（137.388±31.958）、（336.370±57.112）和（211.353±38.913）pg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=33.780，P=0.000）；與Sham組相比，I組升高（P＜0.05），與I組相比，I/R組降低（P＜0.05）。見圖3、4。

圖3 3組大鼠腦組織SOD活性及MDA含量比較（n =10，±s）

圖4 3組大鼠腦組織HMGB1含量比較（n =10，±s）

3 討論

大腦中動脈是缺血性疾病的好發(fā)部位，缺血機制和治療手段的探索一直是神經(jīng)科學領(lǐng)域關(guān)注的重要問題。在腦缺血機制的研究中，血管線栓阻塞大腦中動脈模型應(yīng)用廣泛[8]。本實驗采用該方法分別復(fù)制老年大鼠永久性局灶性缺血模型和缺血2 h后拔出線栓形成的老年大鼠局灶性腦IR模型。

腦IR相關(guān)保護和損傷的機制尚不明確，其中炎癥反應(yīng)可能是重要因素[9-12]。炎癥反應(yīng)中期，機體釋放大量的促炎因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，造成組織水腫甚至損傷；而炎癥反應(yīng)晚期，腫瘤壞死因子-α等細胞因子可促進HMGB1的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，加重組織損傷[13-14]。CHEN等[15]的研究也相同結(jié)果，腦缺血損傷患者血漿中HMGB1表達高于正常人群。但是也有專家認為，IR相關(guān)保護方面的機制研究不足[2]。因此，筆者設(shè)計本實驗，觀察腦IR后梗死體積、SOD、MDA及HMGB1等相關(guān)指標。SOD是細胞內(nèi)主要的抗氧化酶，能清除氧自由基從而抵抗其對細胞造成的損傷。MDA是細胞膜脂質(zhì)氧化后的產(chǎn)物之一，也是細胞遭受氧化應(yīng)激損傷的標志物[16]。本研究觀察IR過程中老年大鼠腦組織中SOD活性及MDA含量，結(jié)果表明再灌注后SOD活性升高，MDA含量降低，提示再灌注可能通過提高抗氧化酶活性，降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物，從而減輕腦缺血后大腦的損傷。

本研究的另一結(jié)果是I組大鼠腦組織中HMGB1的表達高于Sham組，I/R組大鼠腦組織HMGB1的表達低于I組，提示HMGB1參與永久性缺血和IR的炎癥反應(yīng)過程，并且再灌注可能通過降低HMGBI的釋放從而減輕腦缺血后對大腦的損傷。

綜上所述，與永久性缺血相比，IR對腦梗死具有一定的保護作用，該作用可能通過提高抗氧化酶活性，降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物，抑制HMGB1的表達等途徑得以實現(xiàn)，但其具體的分子調(diào)控機制，尚需進一步深入 研究。