p21 codon31基因多態性與宮頸癌的關系

郭海燕，楊少迪，蔣佩

（1.西安市第四醫院 婦產科，陜西 西安 710004；2.中南大學基礎醫學院 生物醫學工程系，湖南 長沙 410083；3.婁底職業技術學院醫學院，湖南 婁底 417000）

宮頸癌是發展中國家女性癌癥病死率的首要因素，其風險因素包括性行為、飲食、人乳頭狀瘤病毒感染及遺傳基因等[1-2]。有研究表明，癌基因的激活及抑癌基因的失活與宮頸癌的形成有相關性[3-6]。因此，遺傳因素成為研究宮頸癌發生、發展機制的熱點。目前國內外研究表明，p21 codon31基因多態性與腫瘤具有相關性，但結果存在很大的差異[7-8]。本文針對p21codon31基因多態性與中國漢族人群宮頸癌患者的統計學、發病風險及臨床病理學參數的關系進行 研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取2014年1月—2016年6月陜西西安及湖南地區漢族宮頸癌患者178例作為研究組，并選取相同時間和地點的237例健康群眾作為對照組。采集對照組外周靜脈血樣本，分裝在抗凝管并于-80℃冰箱內保存。同時，記錄研究對象的詳細臨床資料。其中，對照組均通過巴氏涂片和陰道鏡等檢查，排除宮頸癌和癌前病變的可能性。碘化鉀、硼酸、濃鹽酸、無水乙醇、氯仿、氯化鈉及溴化乙錠均購自北京化學試劑公司，異丙醇、異戊醇、乙二銨四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）、Tris飽和酚、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）相關試劑、Marker DL100 ladder及PCR引物序列合成均購自上海生工生物工程有限公司，BlpI內切酶購自英國New England Biolabs公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest公司，所有試劑均在有效期內按說明書 使用。

1.2 實驗儀器

基因擴增儀購自美國MJ公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，凝膠成像儀購自北京五洲東方科技發展有限公司。

1.3 DNA提取

采用標準蛋白酶K消化和酚/氯仿法抽提研究對象的EDTA抗凝外周靜脈血樣本的DNA，提取后于TE緩沖液中溶解，-20℃保存。

1.4 限制性片段長度多態性分析

取上述DNA模板進行限制性片段長度多態性分析（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）[9]，PCR引物序列見表1。其中，PCR反應體系15μl，包括DNA模板1.0μl，p21正向引物（10μmol/L）1.0μl，p21反向引物（10μmol/L）1.0μl，dNTP（10 mmol/L）0.5μl，10×PCR緩沖液2.5μl，MgCl2（25 mmol/L）1μl，TaqDNA聚合酶（5 u/μl）0.2μl，ddH2O 7.8μl。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環，72℃繼續延伸10 min，取出4℃保存。

表1 p21 codon31基因引物序列

取上述PCR擴增產物7.5μl，10×酶切緩沖液1.5μl，ddH2O 5.5μl，限制性內切酶BlpI0.5μl，酶切反應體系在37℃過夜恒溫培育，取出放置4℃條件下保存。

1.5 測序

采用2%瓊脂糖凝膠電泳法統計每個樣本的基因分型結果，并抽取p21 codon31不同基因型的PCRRFLP產物送至上海生工生物工程公司進行測序驗證。見圖1、2。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 p21 codon31 3種基因型PCR產物測序圖

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件。計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組人口學因素分析

兩組年齡、飲酒及家族史比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組吸煙史比較，差異有統計學意義（P＜0.05），研究組吸煙比例高于對照組。見表2。

2.2 兩組p21 codon31基因型和等位基因分布比較

PCR-RFLP分析后，p21 codon31精氨酸（Arginine, Arg）等位基因片段為272 bp；絲氨酸（Serine, Ser）等位基因被酶切成183和89 bp 2個片段；Arg/Ser雜合子形成272、183及89 bp 3個片段。兩組p21 codon31基因Ser/Ser基因型頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），研究組高于對照組。兩組p21 codon31基因Arg/Ser基因型頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組p21 codon31基因Ser等位基因比較，差異有統計學意義（P＜0.05），對照組高于研究組。見表3。

2.3 p21 codon31基因多態性與宮頸癌風險的 關系

在Logistic回歸分析中，p21 codon31基因多態性與宮頸癌風險相關。p21 codon31基因Ser等位基因攜帶者患宮頸癌風險是Arg等位基因攜帶者的1.345倍（95% CI：1.020，11.772），P=0.035]；p21 codon31基因Ser/Ser基因型攜帶者患宮頸癌風險是Arg/Arg基因型攜帶者的2.01倍（95% CI：1.106，3.654，P=0.021]。

2.4 基因多態性與宮頸癌臨床病理特征的關系

不同宮頸癌組織類型、臨床分期、淋巴結轉移及腫瘤大小的p21 codon31基因多態性比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表2 兩組一般資料比較 例（%）

表3 兩組p21 codon31基因型和等位基因分布比較 例（%）

表4 宮頸癌患者不同影響因素p21 codon31基因多態性比較 例（%）

續表4

3 討論

p21基因定位于人類染色體6p21.2。p21基因編碼一種有效的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，編碼的蛋白結合并抑制CDK2或CDK4復合物的活性[10-12]。p21基因的表達受腫瘤抑制蛋白p53的嚴格控制，該蛋白通過p53介導多種應激刺激下的p53依賴性細胞周期G1期阻滯[13-16]。該蛋白可與增殖細胞核抗原相互作用，在G1/S期DNA復制、DNA損傷修復或細胞凋亡中發揮調控作用。因此，p21基因在抑癌過程中起著重要作用，但關于p21基因突變的報道甚少。其中，p21基因最常見的單核苷酸多態性發生在第31位密碼子（codon31），堿基從AGC突變到AGA（C→A），氨基酸從Ser轉變為Arg[17]。p21 codon31基因是唯一發生在編碼區內的突變，該多態性位點參與腫瘤發生、發展機制的調控。

LIMA等[9]的研究表明，在巴西人群中研究組與對照組的基因型比較有差異，且攜帶p21 codon31基因Ser/Ser基因型的研究組與對照組比較，宮頸癌病變風險增加了2.41倍。MA等[18]的研究表明，在亞洲人群中p21 codon31基因多態性與宮頸癌無顯著相關性，但在白種人群里不同基因型與宮頸癌的關系還需要進一步研究。

本研究與LIMA等[7]的結果一致，p21 codon31基因Ser/Ser基因型患宮頸癌風險比對照組高約2倍，p21 codon31基因多態性與中國漢族人群宮頸癌的發病風險有相關性。

綜上所述，本研究在統計學及臨床病理特征的研究結果顯示，p21 codon31基因多態性與吸煙有關。同時，針對中國漢族人群的結果表明，p21codon31基因多態性與宮頸癌的遺傳易感性有關。目前關于p21 codon31基因多態性的研究較少，可在不同國家不同人群及種族中進一步擴大樣本量進行研究。