酶法合成中長碳鏈甘油三酯

徐文迪，繆智誠，王小三，金青哲，王興國

(江南大學 食品學院，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫 214122)

中碳鏈脂肪酸是含有6～12個碳原子的脂肪酸，在人乳脂中的含量為7%～13%[1-3]。人乳脂中大部分的中碳鏈脂肪酸與長碳鏈脂肪酸結合形成中長碳鏈甘油三酯(MLCT)，約占人乳甘油三酯總量的20%[4-5]。MLCT消化吸收速度快[6-7]，能為嬰兒快速提供能量，還能補充必需脂肪酸。此外，MLCT水解產生的中碳鏈脂肪酸及其單甘酯還具有較強的抑菌和抗病毒活性[8-9]。相關研究[10-11]表明，中碳鏈脂肪酸及其單甘酯能促進乳桿菌和雙歧桿菌的生長，其特定的抗菌活性會影響嬰兒早期腸道菌群的建立。

嬰兒配方奶粉中通常以添加椰子油的形式補充中碳鏈脂肪酸，其所含的中碳鏈甘油三酯與人乳脂中的MLCT存在較大差異[4-5,12]。目前國內外雖已有大量合成MLCT的研究[13-15]，但是合成與人乳脂結構相似的MLCT的報道尚少。人乳脂中的中碳鏈脂肪酸以月桂酸為主[1-3]，而此前研究較多的是辛酸和癸酸。月桂酸的抗菌活性是中碳鏈脂肪酸中最強的[10]，與辛酸和癸酸相比更有利于增強嬰兒對病原體的抵抗力。人乳脂中的MLCT可以分為單中碳鏈甘油三酯(LLM)和雙中碳鏈甘油三酯(MML)，ECN(當量碳原子數)的分布范圍為36～46，集中分布在38～44，其中含量較高的MLCT有OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OMLa、OPCa、LPCa、LLLa、OLaLa及LLaLa[4-5]。

本研究以富含中碳鏈脂肪酸的椰子油和實驗室制備的富含OPO和OPL的油脂為原料，采用脂肪酶NS40086為催化劑，酶法合成和人乳甘油三酯結構相似的MLCT。由于ECN為36、46可能會混入未完全反應的中碳鏈甘油三酯和長碳鏈甘油三酯，因此本研究選擇ECN 為38～44的MLCT的含量作為優化指標，確定酶法酯交換合成MLCT的最優條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

棕櫚硬脂(熔點58℃)，益海嘉里有限公司；椰子油，東海糧油工業(張家港)有限公司；油酸(85%)，阿拉丁有限公司；脂肪酶NS40086，諾維信生物技術有限公司；豬胰脂酶，Sigma- Aldrich (中國)公司；亞油酸(65%)、無水乙醚、甲醇、正己烷、膽酸鈉、氯化鈣、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、鹽酸、乙酸，分析純；乙腈、異丙醇、正己烷，色譜純。

Agilent 7820A氣相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Alltech 3300蒸發光散射檢測器，美國Grace公司；Waters 1525 高效液相色譜儀、2414型示差檢測器、Waters Acquity UPLC、Waters Xevo G2-S Q-TOF質譜儀，沃特世科技有限公司；KDL2短程分子蒸餾設備，德國UIC公司；HH-601恒溫水浴鍋；RT 10磁力攪拌器。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶法合成富含OPO和OPL的結構脂

溶劑法分提棕櫚硬脂：58℃棕櫚硬脂按1∶ 5加入丙酮，于60℃下充分溶解，在38℃下結晶3 h，抽濾得到高熔點棕櫚硬脂，旋蒸除去丙酮。

將分提后的棕櫚硬脂與油酸、亞油酸按摩爾比1∶ 8∶ 4混合，加入底物總質量8%的脂肪酶NS40086，60℃下磁力攪拌反應4 h，反應結束后離心除去脂肪酶，加入1.5倍中和游離脂肪酸所需的0.5 mol/L KOH-乙醇溶液脫除游離脂肪酸[16]，得到富含OPO和OPL的結構脂。

1.2.2 酶法合成中長碳鏈甘油三酯

將制備得到的富含OPO和OPL的結構脂與椰子油(底物)按照一定的摩爾比混合，加入一定量的脂肪酶NS40086，在一定溫度下磁力攪拌反應一段時間，反應結束后離心除去脂肪酶，得到富含MLCT的產物。

1.2.3 分子蒸餾純化酯交換產物

分子蒸餾條件：蒸發面溫度210℃，壓力1 Pa，進料速率2.5 mL/min，刮板轉速120 r/min，冷凝器溫度30℃。

1.2.4 總脂肪酸組成分析

脂肪酸甲酯的制備： 40 mg油樣加入2 mL正己烷，然后加入0.5 mL KOH-CH3OH溶液(2 mol/L)，振蕩1 min，取上清液加入無水硫酸鈉，過0.22 μm有機濾膜后進氣相色譜儀分析。

氣相色譜條件：Trace TR-FAME色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，Thermo Fisher Scientific)；氫火焰離子化檢測器，檢測器和進樣口的溫度均為250℃；升溫程序為初始柱溫100℃，保留1 min，以5℃/min的速率升溫到220℃，保留15 min。

1.2.5 sn-2位脂肪酸組成分析

取100 mg樣品加入2 mL Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)、0.5 mL 0.05%膽酸鹽溶液、0.2 mL 2.2%CaCl2溶液及20 mg豬胰脂肪酶，旋渦振蕩1 min。置于40℃水浴中反應6 min，每3 min取出振蕩30 s。反應結束后加入1 mL 6 mol/L鹽酸和2 mL乙醚，振蕩，5 000 r/min離心3 min，取上清液氮吹至約300 μL。樣品進行薄層色譜層析，展開劑為正己烷-乙醚-乙酸(體積比50∶ 50∶ 1)。刮取sn-2-單甘酯條帶，用乙醚萃取并用氮氣吹干。甲酯化處理方法和氣相色譜分析條件同1.2.4。

1.2.6 甘油三酯組成分析

RP-HPLC-ELSD分析甘油三酯組成。樣品溶于正己烷中，質量濃度20 mg/mL，進樣量10 μL。色譜條件：Lichrospher C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)，柱溫30℃；流動相A為乙腈，流動相B為異丙醇，流速0.8 mL/min，梯度洗脫程序為0～40 min 60%A，45～85 min 55%A，90 min 60%A；霧化室溫度55℃；氣體流速1.8 L/min；增益1。

NP-HPLC分析甘油酯、游離脂肪酸含量。采用配備有Sepax HP-Silica硅膠柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)和示差檢測器的液相色譜儀分析。樣品溶于正己烷中，質量濃度20 mg/mL，進樣量20 μL。色譜條件：柱溫35℃；流動相為正己烷-異丙醇-甲酸(體積比15∶ 1∶ 0.03)，流速1 mL/min。

UPLC-Q-TOF-MS鑒定甘油三酯構型。采用配備BEH C18柱(2.1mm×50 mm, 1.9 μm)和四級桿飛行時間質譜儀的超高效液相色譜系統分析。色譜及質譜條件參考Zhang等[17]的方法。結果中表示的甘油三酯構型未區分位置異構體。

2 結果與討論

2.1 反應底物的甘油三酯組成

椰子油和實驗室制備的富含OPO和OPL的結構脂的甘油三酯組成如表1、表2所示。

表1 椰子油的甘油三酯組成 %

注：Cy. C8∶ 0; Ca. C10∶ 0; La. C12∶ 0; M. C14∶ 0; P. C16∶ 0; S. C18∶ 0; O. C18∶ 1; L. C18∶ 2。下同。

表2 富含OPO和OPL結構脂的甘油三酯組成 %

由表1、表2可知，椰子油的甘油三酯中含有較多的LaLaLa、LaLaCa、LaLaM等，而富含OPO和OPL的結構脂的主要甘油三酯類型為OPO、OPL、PPO和PPL。采用sn-1,3位特異性的脂肪酶催化兩種油脂的酯交換反應，可得到與人乳脂結構類似的MLCT，如OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OMLa、OPCa、LPCa、LLLa、OLaLa及LLaLa等。

2.2 反應體系的確定

酯交換反應分別在無溶劑體系和溶劑體系中進行，探究反應體系對產物中MLCT含量的影響。無溶劑體系：將富含OPO和OPL的結構脂與椰子油按照底物摩爾比1∶ 1混合，加入底物總質量8%的脂肪酶，在60℃下進行反應。溶劑體系：加入3 mL正己烷，其他條件與無溶劑體系相同。產物經RP-HPLC-ELSD分析，結果如圖1所示。

圖1 反應體系對產物中MLCT含量的影響

由圖1可以看出，溶劑體系與無溶劑體系相比，初始反應速率快，在2～4 h內MLCT含量高于無溶劑體系。這是由于溶劑體系中加入了正己烷，降低了體系的黏度，增加了反應底物之間的傳質和熱傳遞，有利于酯交換反應的進行。但是在反應達到平衡時，兩者的MLCT含量沒有顯著性差異，并且無溶劑體系在相同的反應容器中有更高的反應體積，同時省去除去正己烷的步驟，可以節約成本，提高生產效率，有利于工業化生產。綜合考慮，選擇無溶劑體系進行后續反應。

2.3 底物摩爾比的影響

將富含OPO和OPL的結構脂與椰子油(底物)以不同的摩爾比混合，加入底物總質量8%的脂肪酶，在60℃下進行酶催化反應，探究底物摩爾比對產物中MLCT含量的影響。產物經RP-HPLC-ELSD分析，結果如圖2所示。

圖2 底物摩爾比對產物中MLCT含量的影響

由圖2可以看出，當底物摩爾比為1.5∶ 1時，MLCT含量在反應過程中始終低于其他4組。這是由于底物中的長碳鏈甘油三酯的含量偏多，沒有足夠的中碳鏈甘油三酯與之反應，導致產物中的MLCT含量偏低。與之類似，反應底物中的中碳鏈甘油三酯含量過剩，也會導致產物中MLCT的含量偏低。當底物摩爾比為0.8∶ 1時，產物中MLCT含量最高。因此，選擇底物摩爾比0.8∶ 1進行后續反應。

2.4 反應溫度的影響

反應溫度是影響酯交換反應的重要因素，溫度會影響酶的催化活性及穩定性，還會影響反應體系的傳質[18]，尤其是在無溶劑體系中。本研究在底物摩爾比0.8∶ 1，加入底物總質量8%的脂肪酶，反應溫度50～70℃下進行反應，探究反應溫度對產物中MLCT含量的影響。產物經RP-HPLC-ELSD分析，結果如圖3所示。

圖3 反應溫度對產物中MLCT含量的影響

由圖3可以看出，MLCT含量隨著反應溫度的升高而增加。反應在6 h時趨于平衡，此時65℃條件下的產物中MLCT含量達到了70.44%，高于50、55℃及60℃反應條件下MLCT含量。這是由于較高的溫度有利于降低反應體系的黏度，增加底物間的相互作用，加快酯交換反應進程[19]，從而提高產物中MLCT含量。當反應溫度從65℃繼續升高到70℃時，在反應初期，70℃條件下產物中MLCT的含量較高，但在反應達到平衡時，兩者沒有出現顯著性差異。雖然高溫能夠增加反應的初始速率，但會影響酶的穩定性和使用壽命，同時也會增加能耗。綜合考慮，選擇65℃作為最佳反應溫度進行后續反應。

2.5 加酶量的影響

在底物摩爾比0.8∶ 1條件下，加入不同量的脂肪酶，于65℃下進行酯交換反應，探究加酶量對產物中MLCT含量的影響。產物經RP-HPLC-ELSD分析，結果如圖4所示。

圖4 加酶量對產物中MLCT含量的影響

由圖4可知，當加酶量在4%～8%的范圍內時，產物中的MLCT含量隨著加酶量的增加而增多。加酶量為8%～12%比加酶量4%和6%先達到反應平衡，這是由于當加酶量較低時，沒有足夠的酶與底物接觸，導致反應速度慢，反應達到平衡的時間長；隨著加酶量的增多，酶與底物的接觸頻率增加，從而加速酯交換反應[20]。加酶量還會影響反應體系的傳質阻力，當其對傳質阻力的影響大于對反應速率的影響時，繼續增加加酶量對反應的影響不大，這與加酶量從8%增加到12%時MLCT含量沒有出現顯著性差異這一結果相符。為了提高產物中MLCT含量，同時考慮到成本因素，最終選擇8%作為最優的加酶量。此時，反應在6 h時已達到平衡。最優條件下，產物中的MLCT含量為70.44%。

2.6 產物的脂肪酸組成

原料和最優條件下得到的酯交換產物的脂肪酸組成如表3所示。

表3 原料及產物的脂肪酸組成 %

由表3可知：酯交換產物同時含有中碳鏈脂肪酸和長碳鏈脂肪酸，其中總脂肪酸含量最高的依次為月桂酸、棕櫚酸和油酸，這與3種脂肪酸在原料油中的含量較高有關；sn-2位脂肪酸中含量最高的脂肪酸為棕櫚酸，其次是月桂酸，主要是由于兩種原料油脂的sn-2位分別含有高含量的棕櫚酸和月桂酸，經sn-1,3位特異性脂肪酶催化的酯交換反應后，這兩種脂肪酸在sn-2位仍保留較高的含量。

2.7 分子蒸餾純化酯交換產物

采用NP-HPLC分析分子蒸餾前后產物中的游離脂肪酸(FFA)、甘油二酯(DAG)及甘油三酯(TAG)的含量，結果如表4所示。

表4 分子蒸餾前后產物的甘油酯組成 %

由表4可知，經過分子蒸餾之后，產物中的甘油三酯含量從86.07%提高到了97.22%，甘油二酯和游離脂肪酸含量大大降低，表明分子蒸餾對甘油二酯和游離脂肪酸具有良好的分離效果。

采用UPLC-Q-TOF-MS對分子蒸餾后產物的甘油三酯進行分析，結果如表5所示。

表5 分子蒸餾后產物的甘油三酯組成

續表5

甘油三酯[M+NH4]+(m/z)[DAG]+(m/z)含量/%OPL874.73575.47577.48601.492.99±0.24OMO848.73549.47549.47603.512.87±0.13PPL848.73575.47575.47551.490.54±0.09OPM822.69523.44549.47603.514.63±0.18PPM796.69523.44523.44551.463.19±0.11OOO902.77603.53603.53603.530.92±0.05OPO876.74577.48577.48603.513.98±0.15PPO850.73551.48577.48577.484.46±0.18PPP824.73551.47551.47551.471.99±0.11POS878.77577.51579.51605.531.00±0.07PPS852.76551.48579.51579.510.64±0.05OOS904.85605.53605.53603.530.35±0.07

由表5可知，產物中共有44種甘油三酯，與原料中的甘油三酯類型和含量有很大差異，除了部分原料油中原有的中碳鏈甘油三酯和長碳鏈甘油三酯外，還生成了大量的MLCT。根據文獻[1-2,4-5]報道，OPLa是人乳脂中含量最高的MLCT，其在酯交換產物中的含量也最高，而原料中OPLa的含量很低，表明酯交換反應生成了OPLa，達到了預期的效果。其次，酯交換產物中還含有一些人乳脂中含量較高的其他MLCT，如LPLa、LLaO、OLaO、OMLa、OPCa、OLaLa等，其中LPLa、LLaO、OPCa是新生成的甘油三酯，椰子油中雖含有OLaO，但是含量極低，經過酯交換反應之后，OLaO的含量大幅提高。分子蒸餾之后，在人乳脂中含量較高的幾種MLCT(OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OPCa、OMLa、LLLa、OLaLa、LLaLa)的總含量達到37.25%，其中LPLa、LLaO、OLaO的含量達到4.56%、3.76%和5.99%。

3 結 論

本研究以實驗室制備的富含OPO和OPL的結構脂與椰子油為原料酶法合成與人乳脂中結構相似的中長碳鏈甘油三酯(MLCT)。得到的最佳反應條件為：底物摩爾比0.8∶ 1，反應溫度65℃，脂肪酶NS40086添加量8%，反應時間6 h，無溶劑體系。最佳條件下得到的產物中MLCT含量為70.44%。產物經分子蒸餾純化之后，甘油三酯的含量可達97.22%，其中OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OPCa、OMLa、LLLa、OLaLa、LLaLa均是人乳脂中含量較高的MLCT。產物中OPLa含量最高，達6.69%。這種模擬人乳脂MLCT結構的脂質有潛力應用于嬰兒配方奶粉中，使嬰兒配方奶粉的脂質組成更加接近人乳。