亞麻籽提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化保護機制研究

王 榮，楊 寬，陳春妮，趙雪儒，袁啟恒，秦 蓓

(西安醫學院 藥學院，西安 710021)

亞麻又稱胡麻，是最古老的纖維作物之一，也是世界十大油料作物的一種[1]。亞麻籽中含有油脂、蛋白質、木酚素、維生素、黃酮等多種成分[2]。現代藥理學研究表明，亞麻籽提取物具有降血壓、調血脂、抗癌等多種功效[3]。目前亞麻籽的主要臨床應用局限在腸燥便秘、皮膚干燥瘙癢和毛發枯萎脫落等方面[4]。因此，有必要對亞麻籽的藥理活性進行深入研究。

衰老是生物體隨著時間推移出現的不可逆退行性改變。自由基學說是目前衰老公認的且研究最為廣泛的學說。天然產物能夠清除自由基減弱機體的氧化損傷[5]。已有文獻報道，亞麻籽提取物具有抗氧化作用[6]，對CCl4和D-半乳糖胺所致的小鼠急性肝損傷具有保護作用，其作用機制可能與其清除自由基、提高抗氧化能力有關[4，7]。目前關于亞麻籽提取物的抗衰老研究鮮有報道。本研究擬采用D-半乳糖皮下注射建立小鼠亞急性衰老模型，測定小鼠全血和組織(腦、肝、腎)中丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性的變化，全面評價亞麻籽提取物在衰老小鼠體內的抗氧化作用，為亞麻籽提取物的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

亞麻籽提取物，購自陜西嘉禾植物化工有限責任公司，HPLC法檢測亞麻木酚素含量為40%；D-半乳糖，購自上海源葉生物科技有限公司，批號為H20J9C53453；過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒和BCA試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。體重(20±2)g的清潔級雄性昆明小鼠50只，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK(川)2015-030。

1510自動全波長酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific；YP50001電子分析天平，美國OHAUS；Biofuge Stratos高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific；恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；T10微量組織勻漿器，艾卡儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物造模及分組

本實驗方案經西安醫學院倫理委員會批準。實驗動物常規飼養，飼養條件為自然光照，12 h晝夜交替，溫度(20±2)℃，相對濕度為50%～70%，顆粒飼料喂養，自由攝食飲水。小鼠經適應性飼養1周后分組進行處理。50只小鼠，隨機取10只設為正常組，其余40只頸部皮下注射D-半乳糖[8]，給藥劑量為500 mg/kg，小鼠注射體積0.1 mL/10 g，每日1次，連續注射8周。正常組注射生理鹽水。

造模8周后，將40只模型小鼠隨機分為4組，每組10只，分別設為模型組，亞麻籽提取物高、中、低劑量組。小鼠灌胃給藥，灌胃體積0.1 mL/10 g，每日1次，連續給藥6周。亞麻籽提取物組給藥劑量分別為600、300 mg/kg和150 mg/kg，正常組和模型組給予生理鹽水。灌胃同時，正常組頸部皮下注射生理鹽水，其余小鼠繼續頸部皮下注射D-半乳糖。

1.2.2 指標檢測

末次給藥后，小鼠禁食24 h后，眼眶采血，血液抗凝，按試劑盒方法制備溶血液，測定全血中CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量。小鼠脫頸處死，解剖迅速取小鼠胸腺和脾臟計算臟器指數；另取出肝、腦和腎，按質量與體積比1∶ 9加入生理鹽水，冰浴勻漿，制備10%組織勻漿液，2 500 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒方法分別測定各組織勻漿液中CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量。

1.2.3 數據統計

所有數據以“均數±標準差”表示。SPSS 22.0軟件進行數據處理和統計分析，多組間比較采用Oneway-Anova Dunnett雙側t檢驗，P<0.05認為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 亞麻籽提取物對衰老小鼠胸腺和脾臟指數的影響(見表1)

表1 亞麻籽提取物對衰老小鼠胸腺和脾臟指數的影響

注：與正常組比較，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05。下同。

脾臟是外周免疫器官之一，胸腺是重要的淋巴器官，因此脾臟指數和胸腺指數能反映小鼠的衰老狀態。由表1可知，模型組小鼠脾臟指數提高，而胸腺指數降低，與正常組比較，具有統計學差異(P<0.01)，表明造模成功。與模型組相比，亞麻籽提取物高劑量組能顯著降低小鼠的脾臟指數，提高胸腺指數(P<0.05)。

2.2 亞麻籽提取物對衰老小鼠全血和組織中MDA含量的影響(見表2)

表2 亞麻籽提取物對衰老小鼠全血和組織中MDA含量的影響

MDA是脂質過氧化的產物，被認為是衰老的指標，MDA含量隨著衰老而增加。由表2可知，與正常組相比，模型組小鼠全血和組織(腦、肝和腎)中MDA含量顯著增加(P<0.01)，說明造模成功。亞麻籽提取物高、中、低劑量組小鼠全血中MDA含量顯著低于模型組，高劑量組和中劑量組小鼠組織中MDA含量與模型組具有顯著差異(P<0.05)。以上結果表明，亞麻籽提取物能降低衰老小鼠腦、肝和腎臟以及全血中MDA含量，且對全血的影響最顯著。

2.3 亞麻籽提取物對衰老小鼠全血和組織中SOD活力的影響(見表3)

表3 亞麻籽提取物對衰老小鼠全血和組織中SOD活力的影響

SOD是機體抗氧化酶系中一類重要的抗氧化酶，對超氧陰離子自由基具有清除作用，進而減少脂質過氧化反應。SOD的活力能反映機體清除氧自由基的能力。由表3可知，與正常組相比，模型組小鼠全血和組織(腦、肝和腎)中SOD的活力顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組相比，亞麻籽提取物高劑量組和中劑量組顯著提高了小鼠全血中SOD的活力；亞麻籽提取物3個劑量組均顯著增加了小鼠腦和肝組織中SOD活力；高劑量組顯著提高了小鼠腎組織中SOD的活力。結果表明，亞麻籽提取物能提高衰老小鼠全血和組織中SOD的活力。

2.4 亞麻籽提取物對衰老小鼠全血和組織中CAT活力的影響(見表4)

表4 亞麻籽提取物對衰老小鼠全血和組織中CAT活力的影響

CAT亦是機體重要的抗氧化酶系，具有分解過氧化氫的作用，可阻斷脂質過氧化的一級引發反應。由表4可知，模型組小鼠全血和腦、肝、腎中CAT的活力較正常組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。小鼠腦和全血中亞麻籽提取物3個劑量組的CAT活力與模型組相比，具有統計學差異(P<0.05)；亞麻籽提取物高劑量組顯著提高了小鼠肝和腎中CAT活力(P<0.05)。

2.5 亞麻籽提取物對衰老小鼠全血和組織中GSH-PX活力的影響(見表5)

表5 亞麻籽提取物對衰老小鼠全血和組織中GSH-Px活力的影響

GSH-Px通過催化GSH還原過氧化物，進而抑制活性氧的生成。由表5可知，與正常組相比，模型組小鼠全血和腦、肝、腎中GSH-Px活力顯著降低(P<0.01)。亞麻籽提取物高劑量組的小鼠組織中的GSH-Px活力與模型組相比，具有統計學差異(P<0.01)；亞麻籽提取物高劑量組和中劑量組能顯著提高衰老小鼠全血中GSH-Px活力(P<0.05)。

2.6 討論

衰老模型的建立是本研究的第一步。D-半乳糖皮下注射是衰老造模的經典方法。過多的D-半乳糖在醛糖還原酶的催化下，生成半乳糖醇，而半乳糖醇不能被代謝，堆積在細胞內的半乳糖醇導致細胞腫脹、代謝紊亂，最終誘導細胞衰老。本研究以D-半 乳糖連續小鼠頸部皮下注射8周建立衰老模型。胸腺是重要的免疫器官，衰老小鼠的胸腺較其他臟器更易出現萎縮[9]。脾臟是外周的免疫器官，脾腫大是腫瘤等疾病的征兆[8]。由研究結果可知，本研究中模型小鼠胸腺指數降低、脾臟指數增加。MDA通常被作為衰老模型測定的指標，通過檢測發現，與正常組相比，模型小鼠全血和3個重要臟器MDA的含量顯著增加，表明衰老小鼠模型造模成功。

衰老伴隨著心血管、老年癡呆、糖尿病等多種退行性疾病，嚴重威脅生命。衰老自由基學說于1956年首次由Harman提出。大量研究表明，機體內自由基的不斷蓄積與衰老的發生機制有關[10]。機體氧代謝過程中所產生的活性氧過多或其清除速率降低會加速衰老并引發如癌癥、心血管疾病、老年癡呆等各種退行性疾病。因此，抗衰老藥物的研發主要針對以下3個方面：①直接清除自由基；②抑制脂質過氧化；③提高抗氧化酶活力。本研究所用的亞麻籽提取物中亞麻木酚素含量高達40%，已有研究報道木酚素具有抗氧化作用[4，11]。本研究結果顯示，亞麻籽提取物可降低小鼠全血和肝、腎、腦中MDA含量，增加SOD、CAT和GSH-Px的活力，特別是高劑量組的各項指標與模型組相比有顯著差異，提示亞麻籽提取物可通過抑制脂質過氧化反應和激活體內抗氧化酶系發揮對衰老小鼠的保護作用。

3 結 論

本文研究了亞麻籽提取物對D-半乳糖所致衰老小鼠的體內抗氧化作用。結果顯示，亞麻籽提取物高劑量組(600 mg/kg)能顯著降低小鼠的脾臟指數，提高小鼠的胸腺指數，顯示出對衰老小鼠的保護作用。這種保護作用可能與亞麻籽提取物降低小鼠全血和組織(胸、肝、腎)中MDA的含量，增加SOD、CAT和GSH-Px活力有關。