百香果皮多糖的組成及其體外抗氧化活性分析

滕浩，顏小捷，林增學(xué)，戴瑞，劉靜溪，符毓夏

1(桂林旅游學(xué)院 酒店管理學(xué)院，廣西 桂林，541006) 2(廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林，541006)

百香果(PassifloraeduliaSims)，是西番蓮科(Passifloraceae)多年生木質(zhì)藤本植物果實，又名西番蓮，雞蛋果[1]。我國的百香果產(chǎn)地主要分布在廣西、廣東、云南、福建、臺灣和江西等省區(qū)，是一種生長在熱帶、亞熱帶的重要特色經(jīng)濟水果[2]。現(xiàn)有研究表明，多糖是百香果皮的主要功效成分之一[3]，因其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎和降血脂等多種生物活性而受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注[4-6]。百香果加工適用性測定分析結(jié)果表明，其果肉的出汁率可達43.33%，但榨汁后會產(chǎn)生大量的廢棄果皮，極易造成資源的浪費，因此有待進一步開發(fā)利用[7]。

多糖是指由20個以上單糖分子，通過糖苷鍵連接在一起形成的高分子聚合物[8]。因其來源廣泛，具有多種生物活性且毒副作用小而成為生物、藥學(xué)及食品等領(lǐng)域的研究熱點[9-10]。許多天然來源多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抗病毒和抗氧化等方面顯示出良好的應(yīng)用前景[11]，本研究從紫百香果的果皮中提取純化得到百香果皮多糖(passion fruit shell polysaccharide，PFSP)，并對PFSP進行單糖組成和抗氧化活性分析，為PFSP在功能性食品、藥品領(lǐng)域中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果，廣西壯族自治區(qū)北流市；D-(+)-葡萄糖、D-甘露糖、L-巖藻糖、D-(+)-半乳糖、D-(+)-半乳糖醛酸、D-木糖、L-鼠李糖、D-核糖、L-(+)-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，F(xiàn)isher Scientific公司;三氟乙酸，上海科豐實業(yè)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Hei-VAP Advantage型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；LGJ-18S型原位冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展公司；DF206型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市醫(yī)療設(shè)備廠；V-1100型可見光分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；1260 Infinity Series高效液相色譜儀，Agilent公司；Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司；UV-1600紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PFSP的提取與純化

將百香果的果肉和種子去除，收集果皮，用蒸餾水清洗3次，剪成碎塊，置于60 ℃烘箱中干燥，將干燥后的碎塊粉碎后過80目篩，超聲波輔助提取粗多糖[料液比1∶20(g∶mL)，時間15 min，超聲功率400 W，溫度80 ℃，料液pH值為1.5]，收集上清液于60 ℃減壓濃縮，之后用50%(體積分數(shù))乙醇醇沉，12 000 r/min離心5 min，用蒸餾水溶解沉淀，采用Sevage法[12-13]脫蛋白，旋蒸去除有機溶劑，流水透析48 h后蒸餾水透析24 h(透析袋截留分子量為3 500 Da)，經(jīng)真空冷凍干燥得到PFSP組分。

1.3.2 PFSP含量的測定

采用苯酚硫酸法測定PFSP中的多糖含量[14]。準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，蒸餾水補至1.0 mL，分別加入25 μL 80%苯酚和2.5 mL濃H2SO4，30 ℃水浴15 min，可見分光光度計測定OD490的吸光值。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1mg PFSP溶于1 mL蒸餾水中，取20 μL樣品，加980 μL雙蒸水，按照上述步驟測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的多糖含量。

1.3.3 PFSP的紅外光譜分析

取2 mg PFSP，加入KBr研磨壓片，傅里葉紅外光譜儀在4 000～500 cm-1內(nèi)掃描。

1.3.4 PFSP的單糖組成分析

準(zhǔn)確稱取5 mg PFSP，置于5 mL的安瓿瓶內(nèi)，加入4 mol/L三氟乙酸溶液1.0 mL，在120 ℃條件下水解120 min。70 ℃水浴，氮吹儀吹干。然后減壓蒸干，之后多次加入甲醇蒸干，將三氟乙酸完全去除。收集水解蒸干后的多糖樣品，加入少量蒸餾水溶解，然后加30 mg NaBH4，放置于室溫下還原3 h。加25%的乙酸中和過量的NaBH4，減壓蒸干，然后加入甲醇進行多次蒸干。加入3 mL乙酸酐和3 mL吡啶，密封，于110 ℃下反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，減壓蒸干。向水解干燥后得到的單糖樣品中加入溶于無水甲醇的0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮試劑和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，充分混勻后，水浴70 ℃反應(yīng)30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 0.5 mL，充分混勻。加入1 mL氯仿,充分振蕩萃取，去除氯仿層，共萃取3次。水層用0.22 μm濾膜過濾后，待上機。取適量氯仿溶解乙酰化產(chǎn)物，蒸餾水反復(fù)萃取數(shù)次，無水Na2SO4去除多余水分，取氯仿層溶液進行GC分析。

GC分析條件：色譜柱：Thermo C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為0.1 mol/L pH 6.7磷酸鹽緩沖溶液∶乙腈=83∶17(V∶V)，流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL；波長為250 nm。

1.3.5 PFSP的體外抗氧化活性測定

1.3.5.1 PFSP對DPPH·清除作用的測定

按照文獻測定方法[15]，吸取不同濃度的待測溶液2.0 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL，搖勻，放置30 min。以無水乙醇調(diào)零，在517 nm處測定試樣的吸光度(A試樣)。同時，在517 nm處測定對照組(樣品溶液2.0 mL+無水乙醇2.0 mL)混合液的吸光度(A對照)，在517 nm處再測定2.0 mL DPPH溶液與 2.0 mL無水乙醇的吸光度(A0)，如公式(1)所示。

(1)

式中:A0為空白的吸光值；A試樣為樣品的吸光值；A對照為對照品的吸光值。

1.3.5.2 PFSP對羥基自由基清除作用的測定

本實驗采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系[16]，取5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.5 mL，加pH 7.4、0.05 mol/L的磷酸緩沖液2.0 mL,充分混勻后，加7.5 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL，每加一管立即混勻，加0.1% H2O21.0 mL，最后以蒸餾水補充至總體積為10.0 mL。反應(yīng)液在37 ℃下保溫1 h，510 nm處測吸光度(A1)。樣品溶液清除·OH作用，根據(jù)以上實驗操作，分別加入不同濃度多糖溶液1.0 mL后再加H2O2在37 ℃條件下保溫1 h，510 nm處測吸光度(A試樣)。未損傷管不加H2O2及多糖溶液，510 nm處測吸光度(A0)，如公式(2)所示。

(2)

式中:A0為空白的吸光值;A試樣為樣品的吸光值;A1為背景的吸光值。

1.3.5.3 PFSP對超氧陰離子自由基清除作用的測定

鄰苯三酚自氧化系統(tǒng)會產(chǎn)生超氧陰離子自由基反應(yīng)，測定PFSP對超氧陰離子的清除作用[17]。取4.5 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.2)加4.2 mL超純水，充分混合后，在37 ℃水浴下恒溫反應(yīng)20 min，取出后立即加入0.5 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚，迅速混勻后倒入比色皿中，在325 nm波長下，每隔30 s檢測并記錄所測得的吸光值，連續(xù)檢測5 min，計算線性范圍內(nèi)溶液的吸光值增加量。陽性對照組為10 mmol/L的HCl溶液。實驗組為百香果皮多糖的濃度梯度0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24 mg/mL各1 mL，加3 mL的超純水，為反應(yīng)溶液，按照上述步驟測定鄰苯三酚自氧化速率。以10 mmol/L的HCl溶液配制為陽性對照組，測定溶液吸光值。清除率I的計算如公式(3)所示：

(3)

式中:ΔA1/Δt為鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速率;ΔA2/Δt為加入多糖后的實驗組，其鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)速率。

1.3.5.4 PFSP對ABTS+自由基清除作用的測定

按照WANG等[18]報道的方法，測定PFSP對ABTS+自由基的清除活性。取0.2 mL濃度梯度為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24 mg/mL的多糖溶液，隨后加入4 mL的ABTS+自由基稀釋液(7 mmol/L)，充分混合，在室溫條件下反應(yīng)6 min，并以Vc為陽性對照組，同樣條件下，用超純水處理后的液體為空白對照，在734 nm波長下測定的吸光值記為A0，在734 nm下測定各濃度多糖溶液反應(yīng)后的吸光值，記為A1，以超純水代替ABTS+自由基溶液與多糖溶液混合，檢測所得吸光值為A2。如公式(4)所示。

(4)

式中:A0，空白的吸光值;A1，背景的吸光值;A2，樣品的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFSP的紅外光譜

圖1 PFSP的紅外光譜圖

Fig.1 FT-IR analysis of PFSP

2.2 PFSP含量的測定

苯酚硫酸法得到的回歸方程為Y=9.957 6X+0.000 6(R2=0.999 3，其中Y為吸光值，X為質(zhì)量濃度)，經(jīng)測定，PFSP中的總糖含量為80.4%。

2.3 PFSP組分的單糖組成分析

PFSP的全水解產(chǎn)物經(jīng)NaBH4還原、醋酐乙酰化后形成糖醇乙酸酯衍生物進行GC分析，各單糖標(biāo)品保留時間的檢測分析顯示,甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖，阿拉伯糖和巖藻糖的保留時間分別為14.057，18.278，18.863，23.725，27.220，30.126，34.619，36.334，37.827，43.206 min。比較標(biāo)品的保留時間，單糖組成分析結(jié)果顯示，PFSP主要由葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖6種單糖組成，分子摩爾比為14.72∶1.15∶17.29∶1.86∶1.70∶1。SILVA等[20]報道了黃百香果果皮果膠多糖是由半乳糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、核糖和巖藻糖等單糖組成的復(fù)雜水溶性多糖，其中半乳糖醛酸是構(gòu)成黃百香果果皮多糖的主要成分。陳穎珊等[21]研究發(fā)現(xiàn)紫百香果果皮果膠多糖主要由半乳糖醛酸組成，同時含有葡萄糖、核糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖和鼠李糖等，以上相關(guān)研究與本研究結(jié)果基本一致，同時由于百香果的產(chǎn)地、品種及提取方法的不同，其PFSP的單糖組成會存在一些差異，但半乳糖醛酸為其結(jié)構(gòu)的共同主要組成單糖。

圖2 PFSP的單糖組成分析

Fig.2 Monosaccharide composition analysis of PEPP

2.4 PFSP對DPPH·的清除作用

DPPH自由基的清除能力常被用來衡量抗氧化物質(zhì)是否具有清除自由基的能力。PFSP對DPPH·的清除結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，在實驗濃度范圍內(nèi)，PFSP對DPPH·都有一定的清除作用，清除效果與多糖濃度呈量效關(guān)系。當(dāng)PFSP的濃度達到0.24 mg/mL時，對DPPH·的清除率達到82.07%。文良娟等[22]研究發(fā)現(xiàn)百香果皮不同溶劑的提取物對DPPH·都有清除能力，并呈一定的量效關(guān)系，在試驗濃度下，提取物的濃度越高，其對DPPH·的清除作用越強，與本研究結(jié)果基本一致。與此同時，由于不同溶劑的百香果皮提取物之間存在成分組成和純度差異，其清除自由基的活性會有所不同。

圖3 PFSP對DPPH自由基的清除能力

Fig.3 Scavenging activities of different concentrations of PFSP on DPPH·

2.5 PFSP對羥基自由基的清除作用

羥基自由基存在于機體中，會對機體組織或細胞產(chǎn)生不同程度的危害，可導(dǎo)致機體產(chǎn)生氧化和衰老等現(xiàn)象，并進一步誘導(dǎo)機體的組織器官發(fā)生氧化損傷[23]。PFSP對羥基自由基清除率隨著濃度變化的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 PFSP對羥基自由基的清除能力

Fig.4 Scavenging activities of different concentrations of polysaccharide from Passiflora edulis Sims peel on OH·

結(jié)果表明，在實驗濃度范圍內(nèi)，PFSP對·OH有一定的清除作用，其清除率會隨著多糖濃度的提高而增大，且在不同濃度范圍內(nèi)，清除率有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)PFSP組分的濃度高達6 mg/mL時，其對羥基自由基的清除率達到81.52%。ZERAIK等[24]報道不同溶劑的百香果皮提取物可以有效清除羥基自由基，顯示其具有良好的抗氧化活性，且果皮提取物的抗氧化活性隨其用量的增加，其抗氧化活性不斷增強，與本研究結(jié)果基本一致。

2.6 PFSP對超氧陰離子自由基的清除作用

PFSP對超氧陰離子的清除率隨著濃度變化的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，Vc和PFSP對超氧陰離子都有一定的清除作用。在實驗濃度范圍內(nèi)，PFSP對超氧陰離子的清除率會隨著多糖濃度的提高而增加，呈量效關(guān)系。當(dāng)PFSP的濃度為0.24 mg/mL時，其對超氧陰離子自由基的清除率達到22.43%。

圖5 PFSP對超氧陰離子自由基的清除能力

Fig.5 Scavenging activities of different concentrations of polysaccharide from Passiflora edulis Sims peel on superoxide

2.7 PFSP對ABTS+自由基的清除作用

PFSP對ABTS+自由基的清除率隨著濃度變化的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 PFSP對ABTS+自由基的清除能力

Fig.6 Scavenging activities of different concentrations of polysaccharide from Passiflora edulis Sims peel on ABTS+

在實驗濃度范圍內(nèi)，PFSP對ABTS+自由基的清除率分別較低于相同濃度的Vc對ABTS+自由基的清除率，PFSP對超氧陰離子的清除率會隨著多糖濃度的提高而增加，呈量效關(guān)系。當(dāng)PFSP組分的濃度為0.24 mg/mL時，其對ABTS+自由基的清除率達到64.10%。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助法從百香果果皮中提取多糖，經(jīng)純化后得到PFSP組分，苯酚硫酸法測定其總糖含量高達80.4%，主要由葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，分子摩爾比為14.72∶1.15∶17.29∶1.86∶1.70∶1。此外，PFSP組分對4種自由基具有不同程度的清除作用，具有良好的抗氧化活性，提示PFSP作為功能保健食品的天然抗氧化活性因子，可以有效提高百香果的附加值。