止痛化癥膠囊對血瘀證模型大鼠的藥效學研究

吳福林，王涵，董慶海，曹瑩，譚靜，林紅強，李平亞

(吉林大學藥學院，吉林 長春 130021)

婦科血瘀證是以疼痛、腫塊、出血色紫暗或夾有瘀塊等為主要臨床表現的綜合征，是婦科臨床常見的一種病證[1]。中醫學認為,婦科血瘀證可由情志內傷、寒邪侵襲、環境改變等多種原因誘發,其病機實質是瘀阻沖任、胞宮、胞脈,并有不同程度的全身血液運行障礙，主要治療的方法為活血化瘀法。現代醫學研究表明,婦科血瘀證發生機理可能主要在于血液流變學、血流動力學、病理結構的改變及體內免疫系統的功能狀態的改變等方面[2]。臨床實踐發現，氣滯血瘀和寒凝血瘀二種血瘀證類型最為常見[3]。

止痛化癥膠囊(ZhiTong HuaZheng Capsule, ZTHZC)，是由黨參等19味中藥炮制而成。用于氣虛血瘀所致的月經不調、痛經、癥瘕，癥見行經后錯、經量少、有血塊、行經小腹疼痛、腹有癥塊；慢性盆腔炎見上述證候者[4]。近年來，ZTHZC廣泛用于治療痛經、盆腔炎、子宮內膜異位癥及子宮腺肌病等婦科疾病[5-8]，臨床效果較好，但其作用機制還不明確。本研究通過皮下注射腎上腺素結合冰水浴建立大鼠急性血瘀證模型，探究止痛化癥膠囊對血瘀模型大鼠血液流變學、血漿GMP-140及vWF含量的影響，為闡明止痛化癥膠囊的藥效物質基礎及作用機制提供一定的科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗藥品與試劑

止痛化癥膠囊,批號：160502，國藥準字Z22020845，吉林金寶藥業股份有限公司；桂枝茯苓膠囊，江蘇康緣藥業股份有限公司，國藥準字Z10950005，產品批號：171113；鹽酸腎上腺素注射液，上海禾豐制藥有限公司出品，國藥準字H31021344,批號：41170602；大鼠血漿α顆粒膜蛋白(GMP-140)ELISA檢測試劑盒，批號：E20181201A，北京鼎國生物技術有限責任公司；大鼠血管性血友病因子(vWF)ELISA檢測試劑盒，批號：E20181201A，北京鼎國生物技術有限責任公司。

1.2 實驗儀器

FA1104N型萬分之一電子分析天平(上海菁華科技儀器有限公司)；T.G.L-16-aR飛鴿牌離心機(上海安亭科學儀器廠)；KES-900B型血流變檢測儀(無錫康爾生儀器公司)；TECAN SUNRISE 酶標儀(瑞士帝肯集團公司)；DHG-9053A型電熱恒溫干燥箱(上海醫用恒溫設備廠)。

1.3 實驗動物

取Wistar雌性大鼠48只，體質量180～220 g，購置于遼寧長生生物技術股份有限公司，質量合格證號：No.SCXK(遼)2015-0001。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組及給藥

按照大鼠的體質量隨機分成正常對照組、血瘀模型組、止痛化癥膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組及陽性對照組共6組，每組8只。止痛化癥膠囊高、中、低劑量分別為1.60 g/kg、0.80 g/kg和0.4 g/kg，陽性對照組為桂枝茯苓膠囊，劑量為1 g/kg。在室溫(22±2)℃，濕度為40%～60%的飼養室中，適應性飼養1周后，次日上午開始灌胃給藥，灌胃劑量為10 mL/kg，實驗過程中正常對照組及血瘀模型組給予等量的蒸餾水，各給藥組均給予供試藥液，連續給藥7 d。

2.2 急性血瘀模型的制備

除對照組大鼠外，其余各組大鼠灌胃給藥，給藥1 h后，除對照組大鼠外，其它各組大鼠放置0～2℃冰水中，浸泡游泳4 min，連續進行7 d，并于第7天末次給藥1 h后，給大鼠皮下注射0.1%腎上腺素2次，劑量為0.8 mL/kg ，中間相隔時間為4 h，在第 1 次大鼠皮下給予鹽酸腎上腺素注射液 0.8 mg/kg，2 h后，將大鼠置于0～2℃冰水中，浸泡游泳4 min，再過2 h后，注射第2次鹽酸腎上腺素注射液，造成大鼠急性血瘀證模型[9]。

2.3 血液流變學指標的測定

給大鼠第2次注射腎上腺素后，將大鼠禁食不禁水12 h，次日，除對照組大鼠外，其余各組大鼠灌胃給藥，1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛將其麻醉 ，進行大鼠腹主動脈取血。將血液放置在肝素抗凝管中，然后測定大鼠全血黏度和血漿黏度。首先，將放置肝素抗凝管中的血液取出適量，用血流變檢測儀對全血黏度的低切(10/s)、中切(60/s)及高切(150/s)進行測定，然后將余下全血離心10 min，轉速3 000 r/min，取血漿適量進行血漿黏度(140/s)測定。所有的實驗操作在采血后3 h內完成。

2.4 血漿GMP-140及vWF含量的測定

給大鼠第2次注射腎上腺素后，將大鼠禁食不禁水12 h，次日，除對照組大鼠外，其余各組大鼠灌胃給藥，1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛將其麻醉 ，進行大鼠腹主動脈取血，將血液放置在肝素抗凝管中離心10 min，轉速3 000 r/min。吸取上層血漿，分別按照大鼠血漿α顆粒膜蛋白(GMP-140)及大鼠血管性血友病因子(vWF)試劑盒說明書進行測定含量。

2.5 數據處理方法

3 實驗結果

3.1 止痛化癥膠囊對血液流變學的影響

通過對比模型組與對照組數據，結果表明，模型組大鼠全血高、中、低切黏度均明顯增加，血漿黏度明顯增加，數據表明，大鼠急性血瘀模型復制成功。對照組急性血瘀模型大鼠全血高、中、低切黏度及血漿黏度顯著降低(P<0.05，P<0.01)。止痛化癥膠囊中、高劑量組顯著低于模型組血漿黏度以及全血黏度(P<0.01)，低劑量組明顯降低模型大鼠全血高、中切黏度及血漿黏度(P<0.05)。表明止痛化癥膠囊能夠影響急性血瘀模型大鼠的血液流變學，效果顯著，見表1。

表1 止痛化癥膠囊對血瘀模型大鼠全血黏度及血漿黏度的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.2 止痛化癥膠囊對血漿GMP-140及vWF含量的影響

通過比較模型組與對照組，結果表明，模型組大鼠血漿GMP-140及vWF含量明顯增加(P<0.01)。與血瘀模型組相比，桂枝茯苓膠囊能夠明顯降低急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF水平(P<0.01)。止痛化癥膠囊低、中、高劑量組均可使急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量明顯減低(P<0.01)。研究表明，止痛化癥膠囊可使急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF水平明顯降低。見表2。

表2 止痛化癥膠囊對血瘀模型大鼠血漿GMP-140 及vWF含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

4 討論

血瘀證在婦科中是一種常見的疾病,血液循環受到阻礙，瘀血在體內運行不暢均對婦女造成傷害[10]。ZTHZC廣泛運用于治療婦科疾病，其丹參素，丹酚酸B等活性成分已被報道具有抗血栓、抗動脈粥樣硬化及改善血液循環的作用[11-12]。血液流變學能夠評估血液循環狀態，可以作為一種檢測指標[13]，當血液流變學發生異常，就會使人體內的血液循環產生阻礙，就會發生血瘀證，誘發各種疾病。GMP-140是血小板α顆粒膜蛋白，是血小板活化的標志性成分。GMP-140可參與血小板與單核巨噬細胞及內皮細胞的相互作用，能夠反映出體內血小板的活化程度和聚集，對血栓的形成具有監督作用[14-15]。血管性血友病因子vWF可以作為內皮細胞受到傷害的標志性成分，是一種血管內皮細胞和巨核細胞合成的糖蛋白。當內皮細胞受到損害時，可參與血小板的相互作用，使血小板發生聚集、黏附，導致血栓的發生[16-17]。

本研究首次采用皮下注射腎上腺素結合冰水浴建立大鼠急性血瘀證模型，通過檢測血液流變學及GMP-140、vWF試劑盒，探究ZTHZC改善血瘀證的藥效學研究。結果表明ZTHZC中、高劑量組能夠降低血瘀模型大鼠全血高、中、低切黏度，也使血漿黏度顯著降低(P<0.01)，低劑量組也能夠降低模型大鼠全血高、中切黏度降低和血漿黏度(P<0.05)，有明顯改善急性血瘀模型大鼠的血液流變學作用。ZTHZC各劑量組均能夠明顯降低急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量(P<0.01)，從而影響血小板相互作用及活化而達到抗血瘀效果。研究表明，ZTHZC可以顯著改善血液流變學的相應指標，具有改善血瘀證的藥效作用，下一步將從ZTHZC改善血瘀的代謝組學進行分析，明確相關代謝通路，為闡明ZTHZC的作用機制提供科學依據。