小柴胡湯對NTHi誘導的肺部炎癥的影響

陳平安，黃家望，廖燦，袁娉，謝希，陳俊煒，程莉娟*

(1.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208； 3.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙 410208)

不可分型流感嗜血桿菌(non-typeable haemophilus influenzae,NTHi)是一種無莢膜的革蘭陰性桿菌，容易引起非侵襲性感染，造成成人及幼兒肺炎、腦膜炎、中耳炎[1]。它通過寄居于呼吸道黏膜上皮細胞和巨噬細胞，躲避機體對其實施的細胞免疫[2]。 NTHi會在宿主抵抗力下降時大量繁殖，釋放細菌產物，引起炎性細胞因子的釋放和炎性細胞的聚集，導致炎癥的發生。目前國內外還沒有可以預防NTHi感染的疫苗問世，研究NTHi的防治機制仍然十分重要[3-4]。本研究利用小鼠構建NTHi急性肺部感染模型，小柴胡湯為治療藥物，探討小柴胡湯對炎性細胞因子白介素-1β(Interleukin -1β,IL -1β)、白 介 素-6(Interleukin -6,IL-6)、 腫 瘤 壞 死 因 子 -α(Tumor Necrosis factor-α,TNF-α)和粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)表達水平的影響，小鼠肺組織損傷和炎癥的改善程度，為小柴胡湯臨床治療NTHi誘導的肺部炎癥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器

精密分析天平(瑞士Mettler公司AE240)，臺式高速冷凍離心機(美國Thermo)，醫用凈化工作臺(吳江市凈化設備總廠YJ-875A)，-80℃超低溫冰箱(美國Thermo)，超微量分光光度計(德國IMPLEN)，微量移液器(德國eppendorf)，HH-W三用恒溫水浴箱(金壇市大地自動化儀器廠)，DHP-81恒溫箱(上海醫用儀器廠)，石蠟切片機(美國A0820)，超純水儀(millipore公司)，多功能酶標儀(美國bio-tek，Synergy2)。

1.1.2 主要試劑

小鼠IL-1β(Abcam，ab100704)，IL-6(Abcam，ab100712)，G-CSF(Abcam，ab197743)，TNF-α(Abcam，ab100747)ELISIA檢測試劑盒。

1.1.3 實驗菌株

用哥倫比亞巧克力血瓊脂平板在37℃，5%CO2的環境下傳代培養NTHi 12h，無菌生理鹽水重懸細菌，無菌甘油調至20%終濃度，-80℃保存[5]。

1.1.4 實驗動物

6～8周C57小鼠，雌雄各半，體質量(20±2)g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心代購。

1.1.5 實驗藥品

藥物購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院。氨芐西林，聯邦制藥，0.5 g/片，批號：70910804，用雙蒸水配置成0.011 g/mL作為陽性對照藥物。小柴胡湯的主要成分為柴胡24 g，黃芩9 g，姜半夏9 g，生姜6 g，黨參9 g，甘草9 g，大棗4枚。將上述7味中藥，以8倍量蒸餾水浸泡30 min，加熱保持微沸30 min，過濾；殘渣加6倍量蒸餾水，微沸30 min，過濾，合并2次濾液，混合后濾液干燥濃縮至138.8 mL，配成濃度為0.562 g/mL，4℃冰箱保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 NTHi感染小鼠肺炎模型建立

將40只C57小鼠正常飼養2～3天，采用隨機數字表法編號，隨機抽取10只作為正常對照組，其余30只小鼠作為實驗組。通過預實驗篩選出2×105CFU/肺為小鼠感染的造模劑量。照參考文獻[6]方法制備瓊脂珠包裹的NTHi瓊脂珠懸液，對實驗組小鼠進行滴鼻造模，互相感染24h，正常組給予等量滅菌生理鹽水滴鼻干預。采用隨機數字表法將實驗組的30只小鼠分為模型組、氨芐西林陽性對照組、小柴胡湯組，每組10只，分籠飼養，自由飲水取食，并與正常組小鼠分房間飼養。

1.2.2 給藥

正常組和模型組小鼠給予0.4 mL/(20 g·d)灌胃生理鹽水，各藥物組給予0.4 mL/(20 g·d)灌胃相應藥物，連續給藥7 d。動物給藥劑量按動物每公斤體質量占人體表面積的比值計算[7]。

1.2.3 分離血清

最后一次給藥結束后，小鼠禁水禁食8 h，眼眶取血，滅菌1.5 mLEP管收集血液， 4℃靜置2 h，2 500 rpm離心10 min，小心吸取出上層血清，-20℃保存。

1.2.4 檢測小鼠體質量、肺指數及免疫器官指數

記錄造模和給藥期間各組小鼠的體質量。最后一次給藥結束后，禁水禁食8 h，斷頸處死小鼠，取出肺組織、胸腺和脾臟，稱重并記錄。稱重后的肺組織取左肺用4%的多聚甲醛溶液固定，常溫保存，右肺于-80℃保存。臟器指數按如下公式進行計算[8]。

脾指數(mg/g)=脾臟重量(mg)/體質量(g)

胸腺指數(mg/g)=胸腺重量(mg)/體質量(g)

肺指數(mg/g)=肺臟重量(mg)/體質量(g)

1.2.5 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化

取4%多聚甲醛固定的左肺、梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、間斷連續5 μm厚切片，HE染色、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.6 ELISA法檢測小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF表達水平

按照說明書進行標準品的稀釋，每個標準樣本和實驗樣本做3個復孔，向孔內加入生物素標記和酶標抗體，37℃孵育60 min，洗滌拍干重復5次后，先后加入顯色劑A和顯色劑B各50 μL，37℃避光顯色10 min，加入50 μL終止液終止反應，放入酶標儀中用450 nm波長測量各孔吸光度(OD)值，計算出標準曲線的直線回歸方程，算出樣品濃度，分析它們在小鼠血清中的表達水平。

1.2.7 統計分析

2 結果與分析

2.1 各組小鼠狀態

正常組小鼠精神狀態良好，活動能力強，毛發順滑，皮膚緊致，抓取時反抗強烈。模型組小鼠精神萎靡，不好動，毛發豎起，皮膚松弛，經常蜷縮在一起，飲食量少。各藥物組小鼠的狀態較模型組小鼠有不同程度地緩解。

2.2 體質量變化

實驗前均衡好各組小鼠的體質量，使其符合NTHi造模的要求(P>0.05)。NTHi感染小鼠后，模型組小鼠的體質量下降明顯，與正常組比較，差異顯著(P<0.01)。藥物組小鼠的體質量均有不同程度地增加，與模型組比較，有顯著差異(P<0.05)。各組比較結果見表1。

表1 藥物對小鼠體質量變化的影響

注：與正常組同期比較，**P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05

2.3 臟器指數分析

模型組小鼠肺指數明顯增加，胸腺指數和脾指數降低，與正常組比較有顯著差異(P<0.01)。與模型組比較，各藥物組小鼠肺指數均有不同程度地下降(P<0.05)，胸腺指數和脾指數也有一定程度地升高，但無統計學差異。各組比較結果見表2。

表2 藥物對小鼠臟器指數的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

2.4 肺組織炎性細胞因子表達水平比較

模型組小鼠血清中炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF的表達水平明顯增加，與正常組比較有顯著差異(P<0.01)。藥物組小鼠血清中炎性細胞因子的表達水平均有不同程度地下降(P<0.05)。結果見表3。

2.5 HE染色光鏡觀察

正常組:小鼠肺支氣管和肺泡結構完整,肺內未見炎癥細胞浸潤;模型組:肺組織纖維化嚴重,肺泡壁增厚加重,炎性細胞浸潤增多;氨芐西林組:肺組織纖維化減輕,肺泡開始擴張,肺間質未見炎性細胞浸潤,肺組織損傷程度較模型組明顯減輕;小柴胡湯組:肺組織纖維化減輕,肺泡開始擴張,呈修復趨勢,肺間質有少量炎性細胞浸潤,肺組織損傷程度較氨芐西林組無明顯差異,較模型組有所減輕。各藥物組均能不同程度地改善肺組織纖維化及炎癥滲出現象。結果見表4與圖1。

表3 藥物對炎性細胞因子表達含量的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

圖1 各組小鼠肺組織HE染色光鏡觀察(200×)

表4 各組小鼠肺組織病變程度

注：與模型組比較，△P<0.05

3 討論

NTHi是一種無莢膜的革蘭陰性桿菌，其釋放的細菌產物如內毒素、纖毛毒素和蛋白水解酶等，容易導致炎性細胞因子釋放和炎性細胞在呼吸管道和肺部組織聚集，誘發巨噬細胞和肥大細胞脫顆粒。NTHi感染后，白介素(Interleukin,IL)-8、IL-6、和TNF-α的分泌會大量增加，細胞間黏附因子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達含量上升，從而引發炎癥，導致肺組織纖維化和肺泡壁增厚加重[9]。本研究肺組織切片顯示，模型組小鼠肺組織纖維化明顯，肺泡壁增厚加重，炎性細胞浸潤增多，而小柴胡湯組小鼠的肺組織纖維化及炎癥滲出現象得到了一定程度地改善。

NTHi感染誘發的炎癥反應主要是由IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細胞因子介導的[10]。IL-1β來源于周圍和中樞神經細胞，是一種重要的炎性因子，可誘導IL-8、巨噬細胞炎癥蛋白1等多種炎性因子的產生及釋放[11]。IL-6 作為促炎因子，對炎癥反應具有促進和放大的作用。同時，組織細胞受損的程度可以通過測量IL-6的含量得到有效的反映，因此臨床上常用它來診斷急慢性炎癥[12]。TNF-α主要由巨噬細胞和單核細胞產生，可誘導中性粒細胞在肺內聚集，在炎癥反應中發揮著重要的作用[13]。G-CSF是一種糖蛋白，主要通過TNF-α、內毒素和干擾素-γ可活化巨噬細胞和單核細胞產生，它能刺激粒細胞、單核細胞和巨噬細胞成熟，調節中性粒細胞系增殖和分化[14]，臨床上可用G-SCF治療由感染引起的中性粒細胞減少癥。因此，本研究選取IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF為研究靶點，探討了它們在藥物干預前后NTHi感染小鼠血清中的表達水平，旨在為臨床治療NTHi感染提供新的治療方案。

小柴胡湯出自《傷寒論》，由柴胡、黃芩、黨參、甘草、半夏、生姜、大棗七味藥組成。實驗研究證實[15]，小柴胡湯可以降低脂多糖誘導大鼠發熱模型的體溫，并且解熱效果明顯。現代藥理學研究表明[16]，柴胡中的柴胡皂苷可抑制炎性介質如IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放，又能抑制白細胞向炎癥組織聚集，還能改善炎癥組織增生現象。Zhang等研究表明[17]，黃芩中的黃芩苷能通過降低TNF-α mRNA的表達水平，從而減少炎性細胞因子的釋放。另有研究發現[18]，黃芩素可以通過抑制NF-κB通路的活化，從而降低IL-1β、IL-6和IL-8等炎性細胞因子的釋放。本研究臟器指數結果顯示，小柴胡湯能夠增加小鼠的脾和胸腺指數，從而提高小鼠的免疫力，達到治療肺炎的目的[19-20]。炎性細胞因子比較結果顯示，小柴胡湯組炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF較模型組表達水平明顯降低，表明小柴胡湯對以上炎性細胞因子的分泌具有抑制作用，從而緩解炎性反應，其機制可能是通過抑制NK-κB通路的激活來降低炎性細胞因子的釋放，但其具體的作用機制還有待進一步研究[21]。

綜上所述，本研究結果提示小柴胡湯可通過抑制炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF的分泌來緩解NTHi誘導的小鼠肺部炎癥損傷和炎癥程度，為小柴胡湯臨床治療NTHi誘導的肺部炎癥提供了初步理論依據。