肝胃百合湯對慢性應激胃潰瘍模型小鼠Th1/Th2細胞平衡及HPA軸的影響

徐寅，喻斌

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

慢性應激性胃潰瘍是一種特殊類型的胃潰瘍，是指在長期嚴重心理應激狀態下或長期服用對胃黏膜有損害的藥物所致的胃黏膜病變。其發病機制可能與神經內分泌調節、體液免疫反應異常、胃黏膜損傷因素增強或屏障機制減弱、心理應激等有關。前期研究[1-3]發現肝胃百合湯能有效改善胃潰瘍肝胃氣滯證患者的臨床癥狀，可能通過減少白介素-1(IL-1)、TNF-α等炎性介質產生，上調抗炎因子白介素-10(IL-10)的水平，促進表皮生長因子(EGF)的表達，從而修復胃黏膜、抗炎癥反應的治療作用。本實驗在前期研究的基礎上，探討肝胃百合湯對慢性應激性胃潰瘍的治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康BALB/c小鼠(SPF級)40只，均為雄性，6周齡，體質量19～22 g，小鼠購進后常規適應性飼養3 d，動物飼養環境：溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，無不良反應者可納入實驗。實驗動物均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(湘)2011-003。

1.2 實驗藥品

1.2.1 肝胃百合湯

處方：百合15 g，柴胡9 g，郁金9 g，烏藥9 g，川楝子9 g，丹參9 g，白芍9 g，蒲公英15 g，甘草6 g，均購自于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。將上述飲片放入涼水中，并沒過藥物5 cm，浸泡30 min后用武火煎煮至沸騰，再用文火煎煮20 min，過濾藥汁。再用相同方法煎煮第二道，將兩次煎煮的藥汁混合后過濾，濃縮至每1 mL含生藥1 g，放置于離心機中去掉殘渣，4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 鹽酸雷尼替丁膠囊

產自佛山手心制藥，規格為0.15 g/粒，30粒/盒，批號1602224。

1.3 主要實驗儀器及試劑

搖床(其林貝爾TS-92)，恒溫箱(北京六一DYY-6C)，凈化工作臺(YJ 1450)，高速冷凍離心機(TCL16M)，冷凍切片機(萊卡)，切片機(浙江金華益迪試驗器材)，包埋機(常州中威電子儀器)，普通冰箱(榮事達)，精密pH計(雷磁)，數碼凝膠圖像處理系統(GIS-1000)，奧林巴斯攝像顯微鏡(PM 8AD)，Image-Pro-Plus圖像分析軟件(Media Cybernetics)。IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、GC、ACTH、CRH酶聯免疫分析試劑盒均購自于Bio-swamp生物技術公司。

1.4 動物分組及模型制備

將動物適應性飼養3 d后稱質量，按體質量分層隨機分為空白組、模型組、中藥組、西藥組，每組10只，用苦味酸標記后分組飼養。按照相關文獻[4-5]選取10種不可預知刺激因素制備慢性應激小鼠模型，并依據前期預實驗改進方法，具體方法如下：①潮濕墊料+傾斜飼養、熱水泳、禁食24 h、禁水24 h、夾尾5 min、行為束縛、陌生物品、晝夜交替、陌生氣味。每天隨機從上述10種刺激方式中選取1種，需避免前后兩天使用同一種刺激方式。每日上午9點更換刺激方法，連續造模28 d。空白組常規飼養，自由攝食。分別于造模前、造模第14天、第28天觀察小鼠行為學的改變，利用曠場試驗計算各組小鼠水平、垂直、清潔評分，應較空白組明顯減少。抽樣采集小鼠胃組織黏膜，肉眼下及光鏡下發現潰瘍及糜爛。同時符合以上表現則表明模型制備成功。

1.5 給藥方法及途徑

造模14 d后中藥組給予肝胃百合湯灌胃，給藥量為12.2 g/(kg·d)。西藥組給予鹽酸雷尼替丁膠囊(60 kg成人每次用量0.15 g，2次/d)，給藥前用蒸餾水溶解，給藥量為40 mg/(kg·d)。空白組與模型組則給予同等換算體積的蒸餾水灌胃，灌胃容積按照1 mL/(100 g·d)體質量換算。在每日更換造模方法前1 h每組分別給予相應藥物或蒸餾水灌胃。

1.6 觀察指標及檢測方法

實驗過程中觀察小鼠毛色、精神狀況、飲食量、大便情況、行為變化等。利用曠場試驗觀察小鼠水平得分(小鼠四爪全部穿越的方格數，每完全通過1次計1分)、垂直得分(小鼠直立、前爪離開地面或爬在墻壁的次數，每次計1分)及清潔評分(小鼠清潔自己皮毛的次數，每清潔1次計1分)。每次評定完后均應清理干凈小鼠留在箱內的排泄物，防止影響下個動物的評定。取小鼠血清，按照ELISA試劑盒操作步驟檢測IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、GC、ACTH、CRH的含量。

1.7 統計方法

2 結果與分析

2.1 各組小鼠一般行為學變化

空白組小鼠精神良好，毛發濃密，富有光澤，食量正常，活動如常，二便正常，體質量有所增長。造模后模型組、中藥組及西藥組小鼠精神欠佳，萎靡不振，毛發缺乏光澤，食量明顯少于同期空白組小鼠，喜歡聚集，倦怠少動，反應遲緩，大便顏色變深甚至出現黑便，體質量增長幅度緩慢。各組小鼠給予相應灌胃處理后，模型組小鼠精神狀況、食量、活動及大便情況與前相比，未見改善，體質量增長緩慢。中藥組小鼠精神狀態改善，毛發逐漸恢復光澤，反應靈敏，活動增多，食量逐漸增加至造模前水平，體質量增長幅度較前增加，大便逐漸正常，未再出現黑便。西藥組小鼠精神狀態較前稍有改善，毛色無明顯改變，食量較前稍有增多，大便顏色仍較深，但未再出現黑便。

2.2 造模前及治療后各組小鼠曠場實驗評分結果

各組小鼠在造模前行為學指標與體質量組間相互比較，差異無統計學意義(P>0.05)。造模14 d后模型組、中藥組、西藥組小鼠水平、垂直、清潔得分明顯下降，體質量增長緩慢，與空白組相比，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 造模前及治療后各組小鼠曠場實驗評分結果(n=10，分，

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；與西藥組比較，▲P<0.05

2.3 各組小鼠胃黏膜病理改變

光鏡觀察下，空白組胃黏膜光整平滑，無明顯充血、水腫，極個別可見少量點狀糜爛，未見潰瘍及出血點，可見少量炎性細胞浸潤。模型組胃黏膜充血、水腫明顯，可見散在糜爛及點狀潰瘍，上皮破損，炎性細胞浸潤明顯。西藥組胃組織表面尚光整，面膜充血、水腫，可見較多點狀糜爛，未見明顯潰瘍，有較多炎性細胞浸潤。中藥組胃組織表面比較光整，部分黏膜輕度充血、水腫，有少量點狀糜爛，未見明顯潰瘍，有少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組小鼠胃組織病理HE染色圖片(×400倍)

2.4 各組小鼠治療后潰瘍指數

各組灌胃后，與模型組相比，西藥組、中藥組UI數值明顯降低，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。中藥組UI與西藥組相比較低，差異有統計學意義(P<0.05)，中藥組潰瘍抑制率明顯高于西藥組。結果表明肝胃百合湯可明顯降低小鼠潰瘍指數，促進潰瘍愈合。見表2。

表2 各組治療后潰瘍指數及潰瘍抑制率比較

注：與模型組比較，△P<0.01；與西藥組比較，#P<0.05

2.5 各組小鼠血清中GC、CRH及ACTH含量

與空白組比較，模型組血清GC、CRH、ACTH的含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。中藥組、西藥組上述各指標含量與模型組相比明顯減少，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。肝胃百合湯組上述各指標含量低于雷尼替丁組，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表3。

表3 各組小鼠血清中GC、CRH及ACTH含量

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01；與西藥組比較，▲P<0.05

2.6 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的含量

與空白組比較，模型組血清IL-2、IFN-γ含量明顯升高，IL-4、IL-10的含量明顯降低，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。與模型組相比，中藥組與西藥組血清IL-2、IFN-γ減少、IL-4、IL-10的含量升高，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。中藥組與西藥組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，治療后的水平更接近空白組。見表4。

表4 各組小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10含量

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與西藥組比較，#P<0.05

3 討論

社會壓力的日益加大，使得越來越多的人群處于慢性心理應激狀態。機體長期已久的處于應激狀態下，可能導致免疫能力、抗病能力下降，從而產生多種疾病；由慢性心理應激誘發的各種疾病受到了人們更多的關注。根據其他文獻研究[4-5]及前期預實驗，我們選取了10種可行性較高的慢性應激的造模方法，隨機選取給予造模；為了成功模擬慢性應激，需要適度強度刺激以避免由過度強度引起的急性應激；一般情況下，慢性應激的時間需在21 d以上，于是我們采取了28 d以模擬充分的應激時間。依據造模過程中曠場試驗小鼠行為學的改變以及治療前后解剖并活檢的小鼠胃黏膜改變，足以說明運用此種方法可以復制比較理想的慢性應激胃潰瘍小鼠模型。

實驗研究發現，慢性應激能改變胃黏膜的炎癥和免疫反應[6]。慢性應激通過對神經-內分泌-免疫系統的影響，逐漸產生大量炎癥因子，隨著炎癥因子含量升高引起胃黏膜損傷。Th1細胞可由IL-12、IFN-γ誘導而分化，產生IL-2、IFN-γ、IL-12等，同時可抑制Th2細胞的增長；IL-4可誘導Th2細胞分化產生IL-10并與IL-10等細胞因子一起抑制Th1細胞增殖。研究指出，胃潰瘍患者血清IL-2、IFN-γ水平較健康人群高，炎癥因子隨著機體防御系統的啟動釋放，當炎癥因子達到一定水平后，會打破機體免疫防御系統的平衡，導致機體無法繼續正常的產生免疫應答，過度反應增加IL-2、IFN-γ的分泌，并參與胃黏膜損傷過程而加重患者病情。而IL-4、IL-10能抑制Th1細胞產生IL-2和IFN-γ，發揮抗炎作用。本研究發現，模型組小鼠血清IL-2、IFN-γ含量增高，IL-4、IL-10的含量下降，本實驗論證了慢性應激胃潰瘍小鼠存在著Th1/Th2細胞失衡，提示Th1/Th2細胞失衡可能是慢性應激胃潰瘍的病理基礎之一。

HPA軸是以下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal)興奮為主的神經內分泌反應。過度的尤其是慢性應激反應引起HPA軸持續激活，造成糖皮質激素濃度長期處于高水平狀態，從而導致機體出現不同程度的生理、心理障礙，甚至引起軀體疾病。研究認為[7]，機體神經內分泌功能失調，胃黏膜損傷因子作用相對增強，保護因子及其機制削弱等多方面因素都與應激性潰瘍的發生有關。其發生的中樞機制可能是通過下丘腦-交感神經系統、下丘腦-迷走神經系統、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)發揮作用，并進一步影響胃酸分泌及胃黏膜血流量導致潰瘍產生[8]。慢性應激能改變胃黏膜的炎癥和免疫反應，黏膜免疫系統可以由中樞神經系統通過下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)和糖皮質激素(GC)產物調節。同時慢性應激也可以影響HPA軸，上調GC的代謝產物，從而影響胃黏膜。其中，糖皮質激素可以使胃壁細胞數目增多，胃酸和胃蛋白酶分泌增多，導致胃黏膜糜爛、潰瘍愈合延遲[9]，同時糖皮質激素還抑制胃黏膜細胞更新，破壞胃黏膜的完整性，以及HPA軸的亢進使得機體對外源性應激因子的易感性增加，都被認為是HPA軸功能異常而導致胃腸道損傷的途徑。本研究結果提示模型組小鼠血清GC、ACTH、CRH均升高，證實了慢性應激胃潰瘍小鼠HPA軸的失常。

中醫學無“胃潰瘍”病名，根據慢性應激的臨床表現多認為本病與“胃脘痛”“胃瘍”更為接近，病位多責之于肝、胃、脾。慢性應激性胃潰瘍從現代醫學角度來說，多與心理應激因素有著重要的關系。肝胃百合湯由已故名老中醫夏度衡教授創制，夏老根據古時歷代醫家著作及自身多年行醫經驗，提出“后天脾胃難離肝”的觀點，在遣方用藥時非常重視肝胃之間的關系。肝胃百合湯對慢性應激胃潰瘍小鼠胃黏膜損傷的干預作用，且效果優于H2受體阻滯劑(雷尼替丁)，可能是通過使Th1細胞合成IL-2、IFN-γ的能力相對降低，分泌到血漿中的IL-2、IFN-γ也隨之減少，使炎癥反應減輕，同時Th2細胞分泌的IL-4、IL-10水平也上調而抑制了炎癥細胞因子的產生，Th1/Th2細胞間的失衡也得以糾正；減少GC、CRH、ACTH分泌，使糖皮質激素正常發揮對HPA的負反饋機制，以減輕并修復胃黏膜損傷，促進潰瘍愈合。本研究結果提示肝胃百合湯治療慢性應激性胃潰瘍不僅局部修復胃黏膜損傷，且調控Th1/Th2細胞間平衡和調節HPA軸，從神經內分泌免疫網絡途徑減少胃黏膜損傷，修復胃黏膜，治療慢性應激胃潰瘍。