童子益母草質量標準提升研究

孫蕓，班小軍，楊璽文，陳曉青，趙翠琴，謝世斌，張建民

(張掖市食品藥品檢驗檢測中心，甘肅 張掖 734000)

童子益母草為唇形科植物益母草Leonurusartemisia(Lour.)S. Y. Hu的干燥幼苗或基生葉，具有活血調經，利尿消腫，清熱解毒作用，用于月經不調，痛經閉經，惡露不凈，水腫尿少，瘡瘍腫毒[1]。其主要化學成分，生物堿：益母草全草含生物堿 0.11%～2.09%，其中益母草堿(1eonurine)0.02%～0.12%、水蘇堿(stachydrine)0.59%～1.72%和益母草啶(1eonuridine)、益母草寧(1eonurinine)，其主要成分為鹽酸水蘇堿[2]，從主要化學成分來看，水蘇堿在全草生物堿中含量比例最高，所以本標準確定含量測定的生物堿成分首先確定鹽酸水蘇堿。童子益母草雖然沒有被《中國藥典》收載，但作為商品已經在市場上流通使用，近年來，童子益母草常在中藥處方中應用，不僅作用療效好，且價格低廉，深受廣大患者認可。但目前，我國中藥材質量現狀還不容樂觀，特別在我省，由于中藥材地方標準水平偏低，道地中藥材及飲片質量失控現象也比較嚴重，不能有效地控制其質量，對廣泛推廣種植帶來了滯后。所以，只有提升了中藥材及中藥飲片的檢驗質量標準，才能從源頭上更好地控制中藥材及飲片的質量，起到推動我國中醫藥產業鏈的持續發展的作用。

原《甘肅省中藥材標準》[3](2009年版)童子益母草標準項下僅有性狀。為了進一步控制該藥材的質量，本標準增加了藥材粉末鑒別、薄層鑒別、水分、總灰分、浸出物，并采用 HPLC-ELSD法測定了童子益母草中鹽酸水蘇堿。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司);LT-Ⅱ蒸發光散射檢測器(日本島津公司)；TLC Visualizer薄層成像系統(天津大學無線電精密儀器廠)；鼓風干燥箱( 北京科偉永新儀器有限公司)；PH100顯微成像系統(鳳凰光學儀器有限公司)。

1.2 試藥

乙腈為色譜純；其它化學試劑均為分析純；水為純化水；鹽酸水蘇堿批號110712-201312，含量為99.4%，來源：中國食品藥品檢定研究院；童子益母草10個批次(產地：甘肅河西地區三個不同種植地)。

2 方法與結果

參照《中國藥典》2015年版一部及相關文獻資料，確定提升標準的項目進行研究。

2.1 鑒別

參照《常用中藥鑒定大全》[4]益母草項下粉末鑒別及《中國藥典》2015年版一部[1]益母草項下薄層色譜鑒別方法。

2.1.1 粉末顯微鑒別

(1)非腺毛較多。非腺毛1～4細胞。大多向一側偏彎，完整者35～115 μm，頂端細胞約占全長的1/2～2/3，直徑8～25 μm，壁厚2～10 μm，表面有細小疣狀突起。(2)腺麟稀少。頂面觀類圓形或橢圓形，直徑33～50 μm，柄極短。(3)小腺毛頭部1～4個細胞，側面觀類圓形，微扁，直徑18～27 μm，柄短，1～2個細胞。(4)葉片表皮細胞呈多角型，垂周壁平直。(5)草酸鈣針晶細小存在于葉肉細胞中，直徑3～17 μm。(6)草酸鈣方晶呈方形、菱形或多面體，直徑3～15 μm。(7)導管以螺紋導管為主，也可見梯紋、網紋及具緣紋孔導管。見圖1。

2.1.2 TLC鑒別

取鹽酸水蘇堿項下的供試品溶液10 mL，蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，離心，取上清液作為供試品溶液。另取鹽酸水蘇堿對照品，加無水乙醇使溶解(制成每1 mL含1 mg的溶液)，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5～10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶6∶1)為展開劑，展開，取出 ，晾干，在 105℃加熱15 min,放冷，噴以稀碘化鉍鉀試液-三氯化鐵試液(10∶1)混合溶液至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。見圖2。

注:1、7、12為鹽酸水蘇堿對照品，2、3、4、5、6、8、9、10、11為樣品圖2 薄層色譜圖

2.2 檢查

參照《中國藥典》2015年版一部[1]益母草項下水分(干燥法)、總灰分測定方法,對10批不同種植地樣品進行了測定。

2.2.1 水分測定結果

見表1。

2.2.2 總灰分測定結果

見表2。

2.3 浸出物測定

參照《中國藥典》2015年版一部[1]益母草項下浸出物測定方法,對10批不同種植地樣品進行了測定。見表3。

表1 10批不同種植地童子益母草水分測定結果(%)

表2 10批不同種植地童子益母草總灰分測定結果(%)

3 含量測定

參照《中國藥典》2015年版一部[1]益母草項下“鹽酸水蘇堿”測定方法,對10批不同種植地樣品進行了測定。

表3 10批不同種植地童子益母草浸出物測定結果(%)

3.1 色譜分析條件

色譜柱為Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-0.2%冰醋酸溶液(80∶20)為流動相；流速1.0 mL/min；柱溫 ：30℃；蒸發光散射檢測器檢測，漂移管溫度：45℃。理論板數按鹽酸水蘇堿峰計算應不低于6 000。

3.2 對照品、樣品溶液制備

3.2.1 對照品溶液制備

鹽酸水蘇堿，批號110712-201312，來源：中國食品藥品檢定研究院，含量99.4%。精密稱取鹽酸水蘇堿對照品12.75 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.2.2 樣品溶液制備

取本品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇 25 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。對照品和樣品的高效液相色譜圖，見圖3。

圖3 鹽酸水蘇堿高效液相色譜圖

圖4 樣品高效液相色譜圖

3.3 線性關系

分別精密吸取上述對照品溶液5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜峰峰面積。以峰面積的常用對數值為縱坐標(Y)，對照品進樣量的常用對數值為橫坐標(x)進行線性回歸，得回歸方程：Y=1.263 5x+5.199，r=0.999 9，線性范圍為2.5～12.7 μg。

3.4 精密度試驗

取上述對照品溶液(鹽酸水蘇堿濃度為0.51 mg/mL)，重復進樣6次，記錄色譜峰峰面積，其RSD為0.51%(n=6) 。表明儀器精密度良好。

3.5 穩定性試驗

取同一份供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h，進樣量為10 μL，記錄色譜峰峰面積，其RSD為0.87%(n=6)。說明供試品溶液中鹽酸水蘇堿在室溫條件下24 h內穩定。

3.6 重復性試驗

取同一批樣品精密稱取6份，按上述測定方法。平行制備供試品溶液6份，進樣量為10 μL，記錄色譜峰峰面積，其RSD為0.82%(n=6)。

3.7 加樣回收率試驗

精密稱定已知含量的童子益母草供試品6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入上述對照品溶液 1 mL(0.5 mg)，按“供試品溶液的制備”項方法制備供試品溶液 ，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜峰峰面積，并計算回收率。平均回收率為102.76%，RSD為1.41%。見表4。

表4 鹽酸水蘇堿回收率測定結果

3.8 樣品的測定

取樣品照“3．2．2”項下方法制備供試液，進樣10 μL測定 ，照外標法 (峰面積 )計算含量，結果見表5。

表5 10批不同種植地童子益母草鹽酸水蘇堿測定結果(%)

4 討論

實驗采集的三個不同產地的10批樣品都是在甘肅省河西地區人工種植的，擬在原《甘肅省中藥材標準》(2009年版)上增加的項目均參照《中國藥典》2015年版一部益母草項下方法，檢驗方法準確，數據可靠，結果真實。通過大量實驗表明：童子益母草的藥用部位雖然主要是基生葉，但其鑒別、檢查、浸出物及含量測定的結果均達到了《中國藥典》2015年版一部“益母草”項下的規定限度；特別是鹽酸水蘇堿的含量超出藥典標準規定5倍以上，具有良好的線性關系、精密度、準確度、重現性，方法簡便，且可操作性強，為更好地控制甘肅省種植童子益母草質量提供了檢驗檢測方法，是提升中藥材質量標準的重要依據，本次標準提升為進一步研究童子益母草奠定了基礎。