連翹葉中連翹苷元制備工藝的研究

鄧祥敏，朱星宇

(江蘇護理職業學院，江蘇 淮安 223005)

連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb．)Vahl的干燥果實，功效清熱解毒、消腫散結，《神農本草經》有言：“本品主寒熱，癰腫惡瘡，瘰疬，癭瘤，結熱?！迸R床常用于風熱感冒、溫病初起、高熱煩渴、癰瘍腫毒、小便淋閉等的治療[1-2]?，F代研究發現，連翹中主要含有揮發油類、木脂素類、萜類及黃酮類等化學成分[3]，其中木脂素類成分連翹苷元具有抗自由基、抗氧化、保肝等作用[4-5]，但是連翹苷元在連翹果實中含量極低，只有0.008%左右，其連翹葉中連翹苷元含量約為果實中的5～8倍[6-7]，因此從連翹葉制備連翹苷元更具可行性。目前連翹苷元的制備方法主要有微生物轉化法[8]、纖維素酶水解法[9]等，具有工藝復雜，可操作性差，難以規?；a等缺點。

本實驗研究了連翹葉中連翹苷元的制備工藝，具有效率高、成本低、周期短、易于推廣的優點。制備得到純度大于99.0%的連翹苷元單體化合物，為連翹苷元的制備工藝研究以及連翹葉的進一步開發利用提供參考。

1 儀器與材料

AG-135型電子分析天平(梅特勒公司)；安捷倫高效液相色譜儀Agilent1100(美國安捷倫公司)；GL-10M高速冷凍離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)。

連翹葉購于淮安市廣濟醫藥連鎖有限公司(產地山東，批號：20160907)，藥材飲片經黑龍江中醫藥大學藥學院孫慧峰教授鑒定為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb．)Vahl的干燥葉；連翹苷元對照品(批號：170521，寶雞市生物辰光生物科技有限公司，純度>98%)；甲醇為色譜純，95%乙醇，乙酸乙酯為分析純。

2 方法和結果

2.1 分析方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用稀磷酸調節pH值至3.2)-甲醇(45：55)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm；進樣量10 μL。對照品與樣品色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)和供試品溶液(B)色譜圖

2.1.2 對照品溶液配制

精密稱取連翹苷元對照品10.00 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.100 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液配制

精密稱取取樣品約5.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 標準曲線繪制

分別精密吸取“2.1.2”中對照品溶液適量，分別用甲醇稀釋0、2、4、10、20、80倍，按“2.1.1”項下條件測定，以對照品質量濃度(mg·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得連翹苷元回歸方程為Y=451231.34x+1354.725，r=0.9999。線性范圍為:0.013～1.000 μg。

2.2 連翹苷元粗品的制備

2.2.1 提取

根據參考文獻[10]并考慮到生產成本與安全環保等，選擇水作為連翹葉中連翹苷元的提取溶媒，對連翹苷元粗提物的提取條件進行了單因素考察，結果顯示，提取時間在2～5 h范圍內對提取率影響很小，可以忽略，從節約成本、降低能耗考慮，提取時間定為2 h；其他三個因素對提取率影響較大，當提取溫度為60 ℃、溶劑倍數為20倍、提取次數為2次時，提取率最高。單因素考察因素水平見表1。

表1 單因素考察提取條件

在單因素考察的基礎上進行正交試驗，以浸膏中連翹苷元含量為指標，考察因素為提取溫度(A)、溶劑倍數(B)、提取次數(C)。取連翹葉粗粉9份，每份30 g，加水按照正交試驗表對應條件提取，正交試驗方案與結果見表2。

由表2、表3正交試驗結果可見，提取溫度(A)、溶劑倍數(B)、提取次數(C)三個因素對連翹苷元提取率的影響大小順序依次為：C>A>B，即提取次數影響最大，其次為提取溫度和溶劑倍數。理論上最優提取工藝為A2B2C3，但提取次數第2、3水平間差距明顯小于第1、2水平間差距，綜合考慮成本，確定最優提取工藝為A2B2C2，即60℃下，20倍量水，提取2次。按照最優提取工藝制備連翹提取液，將其減壓濃縮至稠膏狀。

表2 連翹苷元正交試驗設計及結果

表3 方差分析表

2.2.2 醇沉

量取“2.2.1”項所得浸膏3份，每份100 mL，進行單因素考察醇沉條件。方法如下：分別加入2、3、4倍量95%乙醇常溫攪拌30 min。醇沉過夜，過濾后取相同體積的濾液稀釋至同一體積，即得供試品溶液，以醇沉濾液中連翹苷元含量及醇沉沉淀中連翹苷元含量為考察指標，考察因素與結果見表4。

表4 醇沉考察因素與結果

由表4結果可知，醇沉體積為4倍量時，濾液中連翹苷元含量最高，沉淀中所剩連翹苷元極少，可以忽略不計，因此醇沉工藝條件為4倍量95%乙醇。

2.2.3 萃取反洗

以連翹苷元溶解度為考察指標，采用單因素考察粗提物萃取反洗工藝，結果連翹苷元在水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯中的溶解度分別為0.02,7.86,5.57,39.3,36.9 g·L-1，其中連翹苷元在二氯甲烷和乙酸乙酯的溶解度明顯優于水、乙醇和甲醇。其在二氯甲烷和乙酸乙酯中溶解度相近，但二氯甲烷毒性較大，因此優選粗提物萃取反洗工藝定為：乙酸乙酯攪拌萃取，水反洗。具體如下：取“2.2.2”項所得粗提物10 g置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯攪拌萃取30 min。乙酸乙酯相加入純化水反洗2次，每次30 min。收集乙酸乙酯相，用旋轉蒸發儀濃縮至稠膏狀，得粗品。粗品含量以連翹苷元計不低于75.0%。

2.3 單次結晶

2.3.1 單次結晶溶劑的考察

以連翹苷元溶解度為指標考察單次結晶溶劑，考察指標與結果見表5。

表5 連翹苷元溶解度的考察

由表5結果可知，連翹苷元在乙酸乙酯中常溫與回流狀態下溶解度都很大，損失較大，不適合做結晶溶劑。連翹苷元在熱乙醇中的溶解度很大，常溫下溶解度很小，甲醇中次之。從環保及危害方面綜合考慮，選用乙醇作為結晶溶劑。但實驗過程中發現，連翹苷元粗提物在乙醇中不易析晶，而在甲醇中很容易析晶。故選甲醇做一次結晶溶劑。

2.3.2 單次結晶條件的考察

精密稱取“2.2.3”項下所得連翹苷元粗品10 g，以結晶溫度、溶劑倍數、結晶時間三個因素對單次結晶的工藝條件進行單因素考察，結果見表6～8。

表6 單次結晶溫度的考察

注：參照2.3.1項溶劑倍數暫定為3倍

表7 單次結晶溶劑倍數的考察

注：結晶溫度為0～4℃

表8 單次結晶時間的考察

注：溶劑倍數為3倍，結晶溫度為0 ℃～4 ℃

由表6～8可知，單次結晶的最佳條件為3倍量甲醇回流溶解，冷卻至室溫，0～4 ℃靜置析晶48 h，晶體用甲醇淋洗，干燥，即得質量分數大于95%的單次結晶。

2.4 重結晶

2.4.1 重結晶溶劑的考察

稱取單次結晶2份，每份10 g，按照“2.3.1”項下方法考察，確定甲醇為重結晶溶劑。

2.4.2 重結晶條件的考察

精密稱取單次結晶3份，每份10 g，按照“2.3.2”項下方法，對重結晶最佳工藝條件進行單因素考察，結果顯示，以3倍量甲醇回流溶解，放至室溫，置于0～4 ℃冰箱內靜置析晶36 h，甲醇淋洗析出晶體，減壓干燥，可得連翹苷元成品，經檢測連翹苷元含量大于99.0%。

2.5 小試工藝驗證

將100 g連翹葉藥材置于2 L圓底燒瓶中，分別加20倍量飲用水，60 ℃浸提2次，每次2 h，浸提結束，過濾，濾液減壓濃縮至密度約1.2 g·mL-1的稠膏，向其加入95%乙醇，調至醇濃度80%左右進行醇沉。抽濾，上清液減壓濃縮至無醇味，得粗提物。

將粗提物置于分液漏斗中，加入15.0 mL的乙酸乙酯萃取30 min，將乙酸乙酯相加入純化水反洗2 次，每次30 min。收集乙酸乙酯相，用旋轉蒸發儀濃縮至稠膏狀，干燥得粗品并測定其質量分數。

向粗品中加入16.0 mL甲醇回流溶解，0～4 ℃下反復靜態析晶，晶體用甲醇淋洗，干燥得單次結晶并測定其質量分數。

向單次結晶中加入13.2 mL甲醇回流溶解，0～4 ℃下反復靜態析晶，晶體用甲醇淋洗，干燥得成品并測定其質量分數。

按上述工藝試驗3批，進一步確定工藝參數，考察工藝的重復性，相關數據見表9。

表9 3批小試的相關數據

由表9可知，最終得到連翹苷元質量為(3.60±0.05)g (RSD為1.47%)，質量分數為(99.11±0.03)g (RSD為0.03%)，收率穩定，工藝可行，為規模化制備奠定了研究基礎。

3 討論

本研究通過單因素考察和正交試驗設計制定了連翹中連翹苷元的最佳制備工藝，實驗中涉及提取、醇沉、萃取、單次結晶、重結晶5個主要工藝步驟，最終確定制備工藝為：以20倍量水，在60℃下提取2次，得到提取物以4倍量95%乙醇進行醇沉，再加乙酸乙酯攪拌萃取，得質量分數大于75.0%的粗品，再將粗品采用甲醇進行結晶，可得質量分數大于99.0%的連翹苷元成品。

近年來研究發現連翹苷與連翹苷元的藥理活性有明顯差異，連翹苷可能是連翹苷元的前體物質[9]，所以研究如何制備連翹苷元，對連翹資源深度開發具有重要意義?，F有的連翹苷元制備工藝首先是制備連翹苷，然后用微生物或者纖維素酶水解，將其轉化為連翹苷元，如此放大生產周期長、成本高、可操作性差，不適合規?；苽溥B翹苷元。在實驗設計初期我們嘗試在提取過程中加入酸水解這一步驟以期促進連翹苷水解成連翹苷元，從而增加其得率，但是發現由于連翹苷水解產生的副產物較多，構型容易轉變，生成的同分異構體難以分離，難以實現后期連翹苷元的分離純化，因此采用直接提取連翹苷元的方法。

本研究摒棄由連翹苷制備連翹苷元的傳統方式，由熱水浸提醇沉再精制的方法直接制備連翹苷元，其過程僅用了乙酸乙酯、甲醇兩種溶劑，有機溶劑種類少，用量少，安全性高。本研究制定的連翹苷元制備工藝與傳統工藝相比，具有操作簡單、工藝用時短、所得連翹苷元成品純度高的優勢。經3批小試工藝驗證，可見該制備工藝穩定、可行，可為試驗和生產中連翹苷元的制備提供一種切實可行的工藝，并進一步擴大連翹苷元的應用和開發。