摻氮碳量子點對光合細菌生長過程的影響

周岳陵,岳正波,胡馥鵬,王 進

摻氮碳量子點對光合細菌生長過程的影響

周岳陵,岳正波,胡馥鵬,王 進*

(合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

以檸檬酸為碳源?乙二胺為修飾劑,一步水熱合成了摻氮碳量子點(N-CQDs).通過分析光合色素?蛋白質(zhì)和丙二醛等生理指標(biāo),研究了N-CQDs對光合細菌生長的影響.結(jié)果表明N-CQDs抑制了的生長并呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系;光合色素分析表明N-CQDs促使菌體的類胡蘿卜素含量提高,菌綠素含量降低;光譜分析表明N-CQDs導(dǎo)致了胞內(nèi)物質(zhì)(如光合色素?蛋白質(zhì)等)的泄漏.N-CQDs較強的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移能力導(dǎo)致培養(yǎng)體系中產(chǎn)生過量自由基,自由基引發(fā)一系列脂質(zhì)過氧化反應(yīng),進而導(dǎo)致生物膜的破裂?物質(zhì)外泄和細菌衰亡.光照下N-CQDs對表現(xiàn)出較高的毒性.研究結(jié)果對于認(rèn)識N-CQDs的光致毒性及其生態(tài)環(huán)境效應(yīng)具有一定的參考價值.

摻氮碳量子點；光合細菌；光合色素；細胞毒性

近年來,隨著碳納米材料的大量開發(fā)與使用,其不可避免地被釋放到環(huán)境中,增加了生物與其接觸的機會.碳納米材料的毒性效應(yīng)和環(huán)境風(fēng)險受到研究者的廣泛關(guān)注[1-3].研究證實多壁碳納米管[4]?單壁碳納米管[5]和富勒烯[6]等碳納米材料對微生物和高等生物具有一定的生態(tài)毒性風(fēng)險.

碳量子點(CQDs)泛指一類粒徑小于10nm,在光激發(fā)下能發(fā)熒光的新型碳納米材料.由于其光吸收和光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移能力以及粒徑小?水分散性良好等特性,CQDs已被證實在眾多領(lǐng)域具有非常好的應(yīng)用前景.但是,CQDs具有豐富的表面官能團和活躍的物化特性,其進入環(huán)境后可能會對環(huán)境微生物造成負(fù)面影響,對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成危害.因此,有必要對CQDs潛在的生物毒性和生態(tài)效應(yīng)進行評估.

關(guān)于CQDs的生物毒性研究涉及的實驗對象有細胞[7-8]、細菌[9-11]、藻類[12]、斑馬魚[13]、老鼠[14]等,研究的生物種類較為有限,得到的實驗結(jié)果也不盡相同.CQDs的細胞毒性通常存在濃度依賴性,濃度越高,細胞毒性越明顯,但同種CQDs對不同類型的細胞可能表現(xiàn)出不同的毒性[7].Biswas等[8]也發(fā)現(xiàn)CQDs對不同的細菌具有不同的毒性表現(xiàn).除細胞和細菌外,研究發(fā)現(xiàn),CQDs對環(huán)境中的生產(chǎn)者藻類也具有顯著的生物毒性,當(dāng)CQDs濃度達到一定數(shù)值時,通常會抑制藻類的生長及其光合作用[12].盡管有研究表明CQDs對魚類和鼠類等動物未表現(xiàn)出明顯的致毒效應(yīng)[13-14],但對于環(huán)境中日漸增多的CQDs,其潛在的生態(tài)毒性和環(huán)境影響應(yīng)當(dāng)引起我們足夠的重視.

近些年來,雖然有關(guān)CQDs的生物毒性研究已廣泛開展,但對于CQDs光感特性與生物毒性之間的認(rèn)識有限.考慮到CQDs的光電活性,其在光照環(huán)境下對環(huán)境微生物的影響可能更大.本文以光敏感性的常見環(huán)境微生物光合細菌()作為研究對象,探討CQDs對生長過程的影響及其潛在環(huán)境效應(yīng),從而豐富CQDs對環(huán)境微生物影響的認(rèn)識,為進一步理解CQDs的生態(tài)效應(yīng)以及評估其生態(tài)風(fēng)險提供參考.

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

光合細菌()由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)盛國平教授饋贈.培養(yǎng)基為HCH培養(yǎng)基[15].

1.2 N-CQDs的制備

在50mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中加入1.0g檸檬酸?10mL超純水以及0.3mL乙二胺,混合均勻后于200℃反應(yīng)5h.自然冷卻后將反應(yīng)液離心10min(8000r/min).上清液用3500Da的透析袋透析2d,得到N-CQDs儲備液,濃度為14.4mg/L(以碳計).

1.3 R. acidophila培養(yǎng)方案

以50mL透明玻璃瓶為反應(yīng)器,培養(yǎng)體積為40mL.每瓶接種4mL的母液(OD660= 1.5).按照實驗設(shè)計加入N-CQDs,鼓氬氣5min后用丁基橡膠塞與鋁蓋封瓶,放置于光照培養(yǎng)箱(光強4500lux,32℃)靜置培養(yǎng).N-CQDs添加量分別為0,1.8,3.6和7.2mg/L(以碳計).每組設(shè)定3個平行.每隔一定時間抽取菌液用于測定OD660?光合色素?蛋白質(zhì)和丙二醛等生理指標(biāo).

1.4 測試方法

光合色素的提取:取5mL菌液,離心收集菌體(12000r/min,30min),5mL蒸餾水洗滌3次.菌體懸浮于5mL丙酮-甲醇(7:2,v/v)溶液中超聲浸提10min (300W,60%),離心收集上清液(12000r/min,10min).重復(fù)上述浸提過程2次,合并提取液用于光譜分析.類胡蘿卜素(Car)和菌綠素(Bchl)含量按Jessen和Beer-Lambert-Bouguer定律進行計算[16].

利用場發(fā)射透射電鏡(JEM-2100F,日本)對N-CQDs形貌觀測表征.利用紫外-可見分光光度計(UV1750,日本島津)?熒光分光光度計(F4600,日本日立)對N-CQDs和培養(yǎng)液進行光譜表征.培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)與丙二醛含量分別采用南京建成生物工程研究所的總蛋白測試盒(A045-2-2)和丙二醛測試盒(A003-1-2)測試.數(shù)據(jù)處理及分析采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.0軟件.

蛋白質(zhì)(Protein)的含量按公式(1)計算.

式中:P為樣品的Protein濃度,g/L;ODT、ODC和ODS分別為樣品?對照和標(biāo)準(zhǔn)品的OD值;S為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,g/L.

丙二醛(MDA)的含量按公式(2)計算.

式中:M為樣品的MDA含量,nmol/mL;ODT、ODC、ODS和ODB分別為樣品、對照、標(biāo)準(zhǔn)品和空白的OD值;S為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,nmol/mL;?為樣品的稀釋倍數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 N-CQDs表征

圖1a表明N-CQDs在340nm處有特征吸收峰,當(dāng)激發(fā)波長為340nm時,熒光發(fā)射峰為460nm.圖1b表明N-CQDs的熒光發(fā)射與激發(fā)波長有關(guān),表現(xiàn)出激發(fā)光依賴性.熒光發(fā)射峰半峰寬較小,說明粒徑分布較為均勻.TEM結(jié)果進一步證實N-CQDs粒徑小于10nm,尺寸分布均勻,顆粒分散性良好,無團聚(圖1c).

2.2 N-CQDs對R. acidophila的生長抑制

如圖2所示培養(yǎng)初期,N-CQD對其生長繁殖過程無顯著影響.但培養(yǎng)至第7d,N- CQD處理組的OD660值均低于對照組,且N-CQDs的濃度越大,OD660值越小.當(dāng)培養(yǎng)至衰亡期(第9d)時,N-CQDs處理組的OD660值下降更快.黃淮青等[9]發(fā)現(xiàn)葡萄糖基熒光碳點(CDs)與調(diào)整期(2h)的酵母菌共培養(yǎng)時,對數(shù)期(10h)時酵母數(shù)量隨著CDs的濃度增大而減少,這與本研究的現(xiàn)象一致.歐陽少虎在研究氧化石墨烯(GO)和氧化石墨烯量子點(GOQD)對小球藻的毒性時發(fā)現(xiàn),兩者均表現(xiàn)為先促后抑.在培養(yǎng)的前48h,這2種碳材料均促進了藻類的生長分裂,而72h后兩者表現(xiàn)出抑制作用[17].N-CQDs對的生長存在抑制,同時會加速細菌衰亡過程.這主要是由于納米材料在被內(nèi)化的過程中,會促進親代與子代細胞壁的分裂,但經(jīng)細菌內(nèi)化后,可能會使菌體細胞逐漸出現(xiàn)結(jié)構(gòu)受損?氧化應(yīng)激增加?細胞代謝被干擾等不良反應(yīng),從而導(dǎo)致菌體的衰亡[17].

如圖2和表1所示,光照培養(yǎng)7d后對照組的生物量最高,各反應(yīng)組生物量隨N-CQDs添加量的增大而降低,當(dāng)N-CQDs濃度為7.2mg/L時,生物量下降9.2%.因此,N-CQDs對的生長過程存在抑制效果,主要體現(xiàn)為降低適應(yīng)期的細菌基數(shù),加速細菌衰亡,繼而使生物量降低,且這一效應(yīng)存在濃度依賴現(xiàn)象.

圖2 N-CQDs對R. acidophila培養(yǎng)過程的影響

表1 培養(yǎng)7d時R. acidophila的干重

2.3 N-CQDs對光合色素的影響

圖3a表明各實驗組均有類胡蘿卜素(Car)和菌綠素(Bchl)吸收峰,說明N-CQDs并未影響中光合色素的種類.圖3b表明Car含量隨N-CQDs濃度的增大而增加,而Bchl含量則隨N-CQDs濃度的增大而降低.Car作為一類輔助色素,能夠捕獲和傳遞光能,還可以保護光化學(xué)反應(yīng)中心,防止光損傷與自由基氧化.研究表明,鹽藻和雨生紅球藻在響應(yīng)環(huán)境脅迫時,會合成和積累大量類胡蘿卜素[18-20].本研究中Car含量增加是自身對N-CQDs脅迫的響應(yīng).Bchl作為光化學(xué)反應(yīng)的主要色素,其含量與活性影響到細菌的生長代謝過程.環(huán)境脅迫將破壞光合作用系統(tǒng),致使葉綠素含量不斷下降[21].細胞內(nèi)的高氧化應(yīng)激壓力也會影響生物體內(nèi)葉綠素a的合成[22].環(huán)境逆境下,細胞體內(nèi)產(chǎn)生的多種活性氧(H2O2,O2-,-OH*,1O2*等)會導(dǎo)致機體的氧化損傷[23],并且葉綠體是主要的靶器官[24].歐陽少虎[17]發(fā)現(xiàn)GOQD會引起小球藻葉綠素a含量降低,他認(rèn)為可能是GOQDs抑制了葉綠素的合成.而本研究中,Bchl含量的降低,可能是N-CQDs破壞了光化學(xué)反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致Bchl的流失和分解.光合色素分析結(jié)果表明N-CQDs對表現(xiàn)出脅迫作用,而細菌通過合成Car來削弱此作用.

2.4 培養(yǎng)液光譜分析

2.4.1 紫外-可見吸收光譜 對照組的初始培養(yǎng)液無特征吸收峰,而N-CQDs處理組則在340nm處出現(xiàn)特征峰.培養(yǎng)12d,各實驗組于390nm處出現(xiàn)一個強吸收峰,且在500nm~600nm間有4個吸收峰,這些吸收峰與活細胞光譜的主要吸收峰相對應(yīng)(圖4a),可能是色素泄漏造成的.程茜茹等[25]發(fā)現(xiàn)沼澤紅假單胞菌的Bchl在光照下容易降解為一種相對穩(wěn)定的中間物質(zhì),該物質(zhì)在390nm處具有強吸收峰.N-CQDs處理組上清液中390nm處的吸收強度隨N-CQDs濃度的增大而增大,說明Bchl的降解加劇.而Bchl的降解通常涉及到羥基自由基以及脂質(zhì)過氧化物[21].N-CQDs可能引起了過度的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),導(dǎo)致細胞膜的損傷,致使更多的胞內(nèi)物質(zhì)(如Bchl a)泄漏到培養(yǎng)基中.而Bchl降解產(chǎn)物的增多,可能是處理組Bchl含量偏低的原因之一.

2.4.2 三維熒光光譜 圖5為對照組和添加7.2mg/ L的N-CQDs處理組不同時期培養(yǎng)液的三維熒光光譜分析結(jié)果.培養(yǎng)第3d,對照組培養(yǎng)液出現(xiàn)新的熒光峰(ex/em=400/465nm)(圖5b),此峰為聚羧酸類腐殖酸物質(zhì),說明此時對照組代謝旺盛.而處理組中N-CQDs峰(ex/em=350/450nm)迅速消失,說明N-CQDs能夠被細菌吸附或內(nèi)化.這可能是由于N-CQDs粒徑小于10nm,極易被內(nèi)化進入菌體內(nèi).但此體系中并未出現(xiàn)ex/em=400/ 465nm熒光峰(圖5f),說明N-CQDs處理組細菌的代謝可能受到限制.N-CQDs處理組第3d檢測到色素的熒光峰(ex/em=390/615nm和ex/em=390/675nm) (圖5f).這說明胞內(nèi)色素發(fā)生外泄,光反應(yīng)中心可能遭到破壞[26].培養(yǎng)至第7d,對照組未檢測到的色素?zé)晒夥?表明其生長狀態(tài)良好,物質(zhì)外流較少;而N-CQDs處理組中的色素?zé)晒夥暹M一步增強,說明胞內(nèi)物質(zhì)在持續(xù)泄漏.

至第12d,細菌進入衰亡期,各實驗組中均檢測到色素?zé)晒夥?圖5d和h).表2顯示隨著N-CQDs的濃度增加,細胞色素的熒光峰強度相應(yīng)增大,進一步證明N-CQDs處理組的細菌衰亡程度更嚴(yán)重.熒光光譜分析結(jié)果表明光照培養(yǎng)下N-CQDs對存在脅迫作用,并且整個生長過程一直存在細菌胞內(nèi)物質(zhì)的持續(xù)泄漏.因此,N-CQDs對的損傷是一個持續(xù)的過程.

表2 色素?zé)晒馓卣鞣宓膹姸?/p>

圖5 不同時刻培養(yǎng)液的三維熒光光譜圖

2.5 N-CQDs對培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)和丙二醛的影響

圖6 培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)和丙二醛含量

丙二醛(MDA)是細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,其含量變化能夠反映細胞膜脂質(zhì)的過氧化程度.脂質(zhì)過氧化反應(yīng)會持續(xù)引發(fā)細胞膜的損傷,進而產(chǎn)生不可逆的破壞,導(dǎo)致細胞死亡,胞內(nèi)物質(zhì)外泄[27].培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)和丙二醛的含量均隨N-CQDs濃度的增大而增高(圖6).蛋白質(zhì)的大量外泄表明N- CQDs導(dǎo)致了菌體細胞膜的受損[28-29].Travlou等[30]研究氮摻雜CQDs的抗菌活性時發(fā)現(xiàn),氨基和酰胺基在水溶液中的質(zhì)子化會使N-CQDs與細菌脂質(zhì)膜發(fā)生靜電相互作用,從而破壞細胞膜.N-CQDs的氮元素?fù)诫s可能加劇了CQDs的毒性.當(dāng)添加7.2mg/L的N-CQDs時,實驗組的MDA含量為對照組的2.3倍.張倩[31]在研究碳納米材料的毒性作用時,檢測到氧化石墨烯(GO)暴露下的微藻的丙二醛含量的顯著升高,發(fā)現(xiàn)GO能夠誘導(dǎo)氧化脅迫,造成微藻細胞的膜脂質(zhì)過氧化.MDA含量的變化也能夠間接反應(yīng)機體細胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度.由于氨基和酰胺基的強給電子能力,N-CQDs能夠誘發(fā)大量活性氧(O2-、OH-、HO2-)的產(chǎn)生[30].這些活性氧會導(dǎo)致的氧化損傷,從而對脂質(zhì)?蛋白質(zhì)?核酸等造成損害,最終導(dǎo)致細胞死亡.

2.6 N-CQDs對R. acidophila的毒性分析

本研究發(fā)現(xiàn)N-CQDs對光合細菌的毒性存在濃度依賴性.培養(yǎng)7d時1.8,3.6,7.2mg/L的N-CQDs使得生物量分別下降了1.1%,5.2%和9.2%(表1).其中生物量抑制率(%)與N-CQDs濃度(mg/L)存在線性相關(guān)關(guān)系(2=0.97).董微等[32]研究也發(fā)現(xiàn)碳量子點對酵母菌的毒性表現(xiàn)出濃度依賴性.雖然碳量子點已被證實具有細胞毒性,但大部分研究表明碳量子點的毒性較小.當(dāng)細胞抑制率(活力或數(shù)量)為10%時,碳量子點的濃度通常大于38mg/L(表3).而本研究中,當(dāng)N-CQDs的濃度為7.2mg/L時,其對的抑制率已達到9.2%.因此,在光照下,N-CQDs可能表現(xiàn)出較高的毒性.

表3 碳量子點的細胞毒性

CQDs具有優(yōu)良的光電性質(zhì),既能作為電子供體也能成為電子受體.在持續(xù)光照下,CQDs通常會產(chǎn)生光生電子-空穴對,形成的空穴和電子被分離且分別遷移到CQDs表面,能夠?qū)⑽皆谄浔砻娴牧u基和水分子氧化成羥基自由基(·OH),這些小分子具有很強的氧化能力,可以破壞或者降解有機物.研究表明CQDs能夠促進羥基自由基和超氧自由基的生成[40-43].這些自由基容易攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸,造成脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致細胞膜失去功能.同時能夠直接和蛋白質(zhì)?核酸等作用,導(dǎo)致細胞的病變或死亡.Biswas等[8]發(fā)現(xiàn)石墨烯量子點(GQDs)暴露下細菌出現(xiàn)物理損傷以及明顯的氧化應(yīng)激行為.本研究中當(dāng)N-CQDs被添加到培養(yǎng)基中,在光照下,體系內(nèi)會持續(xù)產(chǎn)生大量的自由基,從而引發(fā)一系列脂質(zhì)過氧化反應(yīng),丙二醛含量隨N-CQDs的濃度增大而增高.而膜結(jié)構(gòu)中豐富的多不飽和脂肪酸分子,有利于脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生,這些連鎖反應(yīng)對細胞膜造成大量的損傷,最終破壞膜的完整性,導(dǎo)致大量膜蛋白和胞內(nèi)色素的泄漏.N-CQDs對環(huán)境微生物的脅迫作用和光致毒性等,值得進一步關(guān)注.

3 結(jié)論

以檸檬酸和乙二胺為原料水熱合成制得粒徑小于10nm發(fā)藍色熒光的N-CQDs.N-CQDs對光合細菌的生長具有氧化脅迫作用,因此抑制了其生長過程并導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白及光合色素等泄漏.添加7.2mg/L的N-CQDs對的生物量抑制率達9.2%,反映細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的MDA濃度則是無添加對照組的2.3倍.

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致謝：光合細菌由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)盛國平教授饋贈,在此表示感謝.

Effect of nitrogen-doped carbonquantum dots on the growth of photosynthetic bacteria.

ZHOU Yue-ling, YUE Zheng-bo, HU Fu-peng, WANG Jin*

(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)., 2019,39(8)：3396~3403

Nitrogen-doped carbon quantum dots (N-CQDs) were formed by one-step hydrothermal synthesis, using citric acid as carbon source and ethylene diamine as modifierin this study. The effects of N-CQDs on the growth of photosynthetic bacteriawere investigated by analyzing the physiological indexes of photosynthetic pigment, protein and malondialdehyde. The results showed that N-CQDs inhibited the growth ofand showed a concentration-effect relationship. Additionally, N-CQDs increased the content of carotenoid inwhile it decreased the content of bacteriochlorophyll. Furthermore, spectra analysis results showed that N-CQDs led to the leakage of intracellular sbustances such as photosynthetic pigment and protein. The strong light-induced electron transfer ability of N-CQDs resulted in excessive free radicals in the culture system of, which led to a series of lipid peroxidation reactions, which in turn led to the rupture of biofilms, material leakage and bacterial death. N-CQDs had a high toxicity onunder light. The results of this study are valuable for understanding the phototoxicity and ecological effects of N-CQDs.

N-CQDs；photosynthetic bacteria；photosynthetic pigment；cytotoxicity

X171.5

A

1000-6923(2019)08-3396-08

周岳陵(1994-),男,湖南衡陽人,碩士研究生,主要研究方向為環(huán)境生態(tài)修復(fù).發(fā)表論文1篇.

2019-02-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(41772361);中央高?；究蒲许椖?JZ2017YYPY0246)

* 責(zé)任作者, 教授, sophiawj@hfut.edu.cn