長鏈非編碼RNA HOTAIR 對胃癌的診斷及預后價值

李金秋，許崴崴，孫宇佳，王瑩瑩

(吉林大學第二醫院 胃腸營養及疝外科，吉林 長春130041)

胃癌在我國占腫瘤總死亡率的第二位[1]，主要依靠胃鏡下對可疑腫瘤部位取活檢后做病理來確診。腫瘤標志物(CEA,CA125等)對癌癥患者的篩查具有預測作用[2]，但敏感性和特異性較低。近年來隨著非編碼RNA的發現，其在癌癥組織和健康組織中存在差異性表達成為研究熱點，并有望成為腫瘤的新的血清學標志物及治療的靶點[3]。HOTAIR作為一種長鏈非編碼RNA已經被證實在胃癌組織中高表達[4]，故本文通過檢測胃癌組織中HOTAIR表達差異性并應用生存曲線來明確HOTAIR對胃癌的診斷及預后價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2010年1月—2014年12月就診于吉林大學第二醫院胃腸營養及疝外科的胃癌患者115例。全部患者均行手術治療，并經病理學組織活檢確診為胃癌。排除標準：①腫瘤廣泛轉移者。②胃癌合并嚴重肝、腎、腦、血液等多器官功能衰竭病例。③術前進行輔助放化療。④在院死亡病人。其中男73例，女42例，平均年齡58.0±5.8歲。有吸煙史48例，飲酒史54例。腫瘤分期Ⅰ19例，Ⅱ13例，Ⅲ41例，Ⅳ42例。其中低分化49例，高中分化66例。本實驗經吉林大學第二醫院倫理委員會審核并批準，全部患者在手術前簽署本項目知情同意書。

1.2 方法全部患者標本均為術中手術切取獲得。其中胃癌組織標本115例，為癌組織中心部位切取，均經病理證實，作為觀察組。同時切取距癌癥組織5 cm以上的癌旁正常組織作為對照組，上述組織經HE染色確定為正常組織。手術標本在切取后立即放入液氮保存并轉運至-80℃冰柜。RNA提取采用TIANDZ(天恩澤)試劑盒，自備氯仿，提取步驟根據TIANDZ說明書進行。NanoDrop2000 超微量分光光度計進行RNA濃度及純度的檢測，純度OD260/OD280選擇在1.8-2.0之間的RNA。

RNA逆轉錄為cDNA采用All In One cDNA逆轉錄試劑盒，逆轉錄過程嚴格按照All In One cDNA試劑盒說明書進行，逆轉錄所用RNA量為1 μl，總反應體系13 μl。反應條件為60℃10 min，4℃5 min。逆轉錄的cDNA放在冰中保存并進行下一步反應。

實時定量PCR:操作儀器為ABI公司生產的7500 Real time PCR機器，采用ABI公司生產的配套96孔PCR板，反應體系為20 μl，采用All In One PCR試劑盒。因為根據Primer-primer設計并由華大基因公司設計，具體序列見表1，反應條件為:95 ℃ 10 min;95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles；95℃15 s，60℃ 1 min，95℃15 s。每組樣品均設3 個重復。

表1 熒光定量引物表

2 結果

將胃癌和癌旁組織的128個下調表達和673上調表達的基因進行火山圖繪制，見圖1。在115例胃癌患者組織標本中，HOTAIR 均在癌細胞組織中表達，診斷陽性率達100%。RT-PCR檢測結果發現HOTAIR在觀察組(4.58±0.92)和對照組(0.51±0.42)之間呈現差異性高表達，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

HOTAIR高表達和腫瘤大小及分化程度相關，而和年齡及性別無關，見表2。

Kaplan Meier曲線顯示HOTAIR高表達病人預后較低表達病人預后差，(P<0.05)，見圖3。

圖1 胃癌組織與癌旁組織差異表達基因火山圖

圖2 RT-pcr檢測HOTAIR在胃癌及癌旁組織的表達量

3 討論

胃癌作為消化道最常見的惡性腫瘤，占我國腫瘤死亡率的第二位[5]，主要是因為缺乏有效的早期檢查手段。大部分患者就診時已為進展期胃癌。胃鏡作為胃癌的主要診斷方法因在檢查過程中患者感到疼痛而無法用于廣泛普查。腫瘤血清標志物雖然對胃癌有一定的提示作用，但其缺乏準確性和特異性也無法對胃癌進行早期的診斷。故有效的簡單、快捷并且特異性和準確性高的檢驗方法迫在眉睫。

表2 胃癌組織中HOTAIR 表達量與臨床病理參數的關系

*P<0.05

圖3 Kaplan Meier曲線顯示HOTAIR高表達病人預后

近年來，長鏈非編碼RNA[6]逐漸被發現在腫瘤的發生和發展中起到關鍵作用。其是一種長度大于200個核苷酸的不具備編碼功能的RNA，早期被認為是轉錄過程中的“噪音”，而現研究顯示其在許多疾病特別是腫瘤疾病中呈現異常的表達并參與腫瘤細胞的發生、進展、轉移及耐藥過程。其是通過基因印記、染色質修飾、轉錄前調控等作用參與到蛋白質的最終表達從而發揮調控作用。而且此種非編碼RNA在血清中穩定存在[7]，故可能成為腫瘤及某些疾病的血清學標志物。和既往研究的編碼蛋白基因相似，其也分為促癌基因和抑癌基因，其中HOTAIR即是一種促癌基因。先前研究證實，HOTAIR在胃癌組織和正常組織中差異性表達[8]，預示其可能成為胃癌診斷的潛在血清學標志物，但尚未進行大樣本驗證。故本文通過驗證HOTAIR是否在全部胃癌患者中差異性表達，并推論其在遠期生存率的診斷價值。

通過RT-PCR對全部胃癌組織及癌旁組織提取的RNA進行反轉錄和擴增后發現，HOTAIR在全部胃癌組織中均呈現高表達，且差異有統計學意義，說明胃癌患者HOTAIR高表達陽性率達到100%，具備潛在腫瘤標志物檢測標準，和諸多研究結果相似[4,8]。文中19例I期胃癌患者組織中HOTAIR表達依然和正常癌旁細胞呈現差異性表達，說明HOTAIR可作為胃癌診斷的早期腫瘤學標志物。進一步對差異顯著的HOTAIR進行細分，驗證高表達和低表達HOTAIR對胃癌患者腫瘤參數的診斷價值發現，高表達的HOTAIR和腫瘤大小及分化程度相關，差異有統計學意義。說明HOTAIR和腫瘤的發生發展過程相一致，側面說明HOTAIR在腫瘤早期即開始表達并隨著腫瘤的發展逐漸呈現增高趨勢。通過生存曲線分析發現HOTAIR高表達患者5年生存率明顯低于低表達患者，原因和上述分析相似，即HOTAIR表達越高說明腫瘤發生發展時間較長，更有可能出現轉移，說明HOTAIR表達水平對胃癌的預后具備診斷價值。

總之，通過對大樣本的驗證發現HOTAIR在胃癌組織中呈現高表達，對胃癌患者具備早期診斷價值。而且HOTAIR和胃癌患者腫瘤大小及分化程度及5年生存率相關，對胃癌患者的患病時間及遠期生存率均有診斷價值。