成骨細(xì)胞條件性FKBP8基因敲除小鼠模型構(gòu)建

王 紅，孫 鵬，王 巖，張武鋦，張 晟*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州510630；2.廣東省骨科研究院，廣東 廣州510630; 3.廣東省骨科醫(yī)院，廣東 廣州510630；4.中山大學(xué)腫瘤防治中心麻醉科，廣東 廣州510060; 5.華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東 廣州510060；6.腫瘤醫(yī)學(xué)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州510060; 7.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130000；8.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物教研室，廣東 廣州510515)

FKBP8是膜伴侶，其主要定位于線粒體并含有COOH末端。FKBP8與其他FKBP家族成員的不同之處在于該活性依賴與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合。FKBP8通過將抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL募集到線粒體來抑制細(xì)胞凋亡[1]。FKBP38缺陷的小鼠在出生后不久死亡，表現(xiàn)出神經(jīng)管閉合的缺陷，其部分原因是無限制的細(xì)胞凋亡[2]。FKBP8在線粒體自噬過程中，Bcl-2從線粒體轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這是一種自噬形式，負(fù)責(zé)消除受損的線粒體[3]。FKBP8在許多方面是FK506結(jié)合蛋白的特殊成員。除了在程序性細(xì)胞死亡中的這種作用之外，F(xiàn)KBP8似乎涉及非常不同的細(xì)胞過程，其不一定依賴于FKBP結(jié)構(gòu)域。這些功能涉及激酶mTOR的調(diào)節(jié)[4]，神經(jīng)管形成的調(diào)節(jié)，細(xì)胞缺氧反應(yīng)的調(diào)節(jié)，以及丙型肝炎病毒復(fù)制[1,5,6]。因此，F(xiàn)KBP8可能與細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的體內(nèi)退行性病變骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是以骨質(zhì)量丟失、骨組織微觀結(jié)構(gòu)退變致使骨脆性增加并易于發(fā)生骨折為特征的代謝性骨病[7]。目前，我國(guó)有近1億骨質(zhì)疏松癥患者，居世界首位。由于骨質(zhì)疏松引起的各種脆性骨折是導(dǎo)致老年人病殘和死亡的重要原因，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為嚴(yán)重危害公眾健康的社會(huì)問題。現(xiàn)階段對(duì)骨質(zhì)疏松的藥物治療主要是鈣劑、維生素D和骨吸收抑制藥(包括雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽等) 等三大類藥[8]。

目前認(rèn)為，破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)的骨吸收和成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)的骨形成作用間的動(dòng)態(tài)平衡和偶聯(lián)是維持正常的骨生理功能和骨量的基礎(chǔ)，許多激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子相互聯(lián)系，相互制約，控制骨代謝水平和破骨/成骨活性的平衡。由于衰老、雌激素缺乏或藥物等因素造成這種平衡的破壞使骨吸收超過骨形成，從而引起骨丟失與骨質(zhì)疏松[9]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BGLAP-Cre小鼠 (019509 B6N.FVB-Tg(BGLAP-Cre)1Clem/J)購(gòu)自Jackson Laboratory(美國(guó)),FKBP8f/f小鼠由趙子健教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。野生型C57BL/6小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)方案得到南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2試劑 鼠尾基因組裂解液：A液(500 mM EDTA、100 mM NaOH、pH8.0)，B 液(1M Tris-HCL、PH8.8)均為南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室配制；瓊脂糖(TSJ001)、EB替代物(TSJ002)購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；PCR引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成； FKBP8抗體購(gòu)自Thermo Scientific公司；全蛋白提取試劑盒(KGP2100)、凱基生物 BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(KGP902)購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；5%牛血清白蛋白購(gòu)自Sigma(美國(guó))；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1小鼠的飼養(yǎng)與繁殖 小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)、溫度22-25℃、濕度55%-60%動(dòng)物房。使用嚙齒類動(dòng)物繁殖飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。BGLAP-Cre小鼠引進(jìn)后采用BGLAP-Cre陽(yáng)性小鼠與野生型小鼠(C57BL/6)交配繁殖；FKBP8loxp/loxp小鼠引進(jìn)后與野生型小鼠(C57BL/6)交配獲得雜合子后代、后續(xù)采用雌雄均為雜合子進(jìn)行交配繁殖保種。

1.2.2成骨細(xì)胞條件性敲除FKBP8基因敲除小鼠的構(gòu)建 將BGLAP-Cre小鼠與FKBP8loxp/loxp交配，繁殖出BGLAP-Cre/FKBP8loxp/+F1代小鼠,由F1 代BGLAP-Cre/FKBP8loxp/+和FKBP8loxp/loxp交配，得到BGLAP-Cre/FKBP8loxp/loxp小鼠。

1.2.3基因型鑒定 小鼠基因組DNA提取：剪取小鼠鼠尾，堿裂解法提取小鼠DNA。鼠尾DNA樣品作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)目的基因上下游引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶進(jìn)行結(jié)果鑒定。PCR反應(yīng)體系：PCR-Mix 10 μl、引物F 1 μl、引物R 1 μl、2 μl模板、6 μl ddH2O，共20 μl。引物序列見表1。

表1 基因鑒定引物

1.2.4小鼠敲除效果驗(yàn)證 選擇同窩同性別CKO小鼠和BGLAP-Cre陰性小鼠。用全蛋白提取試劑盒提取小鼠原代成骨細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，對(duì)FKBP8表達(dá)水平進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 BGLAP-Cre、FKBP8flox/flox和BGLAP-Cre(FKBP8flox/flox)小鼠基因型鑒定

BGLAP-Cre小鼠和野生型小鼠(C57BL/6)交配繁殖，獲得BGLAP-Cre 表達(dá)陽(yáng)性的小鼠，BGLAP-Cre小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖1；FKBP8小鼠雌性雜合子與雄性雜合子交配繁殖，鑒定flox位點(diǎn)，子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖2；將基因型為BGLAP-Cre(FKBP8f/+)F1代小鼠與基因型為FKBP8f/f小鼠交配，獲得F2代小鼠，其中基因型為BGLAP-Cre(FKBP8f/f)即為條件性敲除小鼠，如圖3。

2.2 FKBP8基因敲除效果

選擇F2代KO小鼠，提取KO小鼠和CON小鼠原代成骨細(xì)胞蛋白，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。圖4結(jié)果所示， FKBP8 基因在成骨細(xì)胞的表達(dá)基本不表達(dá)，蛋白分析結(jié)果表明FKBP8 基因已經(jīng)在成骨細(xì)胞中被敲除。

注：樣品3、6、7為單一亮帶，為表達(dá)BGLAP-Cre重組酶陽(yáng)性小鼠；1、2、4、5、8無條帶，為BGLAP-Cre重組酶陰性小鼠；樣品M為Marker

圖1 BGLAP-Cre小鼠基因鑒定結(jié)果圖

注：樣品3、4、8為FKBP8純合子小鼠(FKBP8flox/flox)，可見272 bp 單一亮帶；樣品1、2、5、7為野生型b6小鼠，可見單一217 bp 亮帶；樣品6為雜合子；樣品M為Marker。

圖2 FKBP8小鼠基因鑒定結(jié)果圖

注：樣品7為FKBP8 純合子表達(dá)BGLAP-Cre陽(yáng)性小鼠(FKBP8flox/flox;BGLAP-Cre)；樣品2、3、4、5、6為FKBP8雜合子表達(dá)BGLAP-Cre陽(yáng)性小鼠(FKBP8flox/-;BGLAP-Cre)；樣品1為FKBP8 雜合子表達(dá)BGLAP-Cre陰性小鼠(FKBP8+/-)；樣品8為BGLAP-Cre陽(yáng)性小鼠。

圖3 BGLAP-Cre(FKBP8flox/flox)基因型鑒定結(jié)果圖

圖4 Western blot驗(yàn)證FKBP8基因敲除效果

3 討論

本研究構(gòu)建成骨細(xì)胞條件性敲除FKBP8基因小鼠，為闡明FKBP8在骨質(zhì)疏松癥的作用提供小鼠動(dòng)物模型。本研究通過Western blot驗(yàn)證小鼠敲除效果 KO組與對(duì)照組FKBP8蛋白表達(dá)量差異明顯，敲除效果明顯。

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種常見疾病，其特征在于骨質(zhì)量和微結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)性損傷，導(dǎo)致脆性骨折[10]。據(jù)估計(jì)，到2025年，僅美國(guó)骨質(zhì)疏松癥引起的骨折發(fā)病率就高達(dá)每年300萬(wàn)例[11]。目前，骨質(zhì)疏松癥已成為影響人們生活質(zhì)量的流行病之一，因其在全世界的病因多樣，病因復(fù)雜。在臨床實(shí)踐中，大多數(shù)骨質(zhì)疏松癥患者是絕經(jīng)后的老年女性，發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)性同時(shí)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制起作用[10,12,13]。

FKBP8近來研究表明與體內(nèi)細(xì)胞凋亡進(jìn)行相關(guān)，F(xiàn)KBP8心臟條件性敲除小鼠與野生型小鼠抗心衰能力不同[2]，說明FKBP8基因在特定組織的作用尚不能確定。本研究采用成骨細(xì)胞特異性Cre重組酶小鼠，構(gòu)建出成骨細(xì)胞特異性敲除FKBP8基因小鼠，為研究FKBP8在成骨細(xì)胞發(fā)育過程及骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中的作用機(jī)理。進(jìn)一步為骨質(zhì)疏松癥的治療靶點(diǎn)尋找提供動(dòng)物模型。