流式熒光發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)肺癌患者血清CEA、CYFRA21-1、CA125及NSE的性能評(píng)價(jià)

趙 虹,紀(jì)秋野，王博揚(yáng)

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130033)

肺癌已經(jīng)成為一種常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型，并被確定為中國(guó)癌癥死亡的主要原因[1]，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段過(guò)程，伴隨著諸多分子及細(xì)胞生物學(xué)改變。有一系列的腫瘤標(biāo)志物在肺癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，并且其在肺癌的診斷和后續(xù)治療監(jiān)測(cè)中也顯得尤為重要[2]。例如神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，即是小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者的一種可靠的腫瘤標(biāo)志物[3],而癌胚抗原(CEA)、癌胚抗原125(CA125)及細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)則被廣泛的應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的研究中，而且CYFRA21-1的敏感性最強(qiáng)[4-9]。因此，選擇一種合理的腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法，在癌癥患者疾病分型及后期用藥療效觀察方面均起到了至關(guān)重要的作用。目前常用的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法主要有放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、電化學(xué)發(fā)光法( ECLIA)等。本實(shí)驗(yàn)采取的流式熒光發(fā)光法是一種基于熒光編碼微球和流式技術(shù)相結(jié)合的高通量發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，對(duì)CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的血清表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性等方面其進(jìn)行分析和評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)標(biāo)本

選擇2018年3月至2018 年8月末，吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院門(mén)診和住院的患者40例，用含分離膠和促凝劑的真空采血管采集各研究對(duì)象的空腹靜脈血3 mL，室溫靜置，3 500 r /min離心5 min，分離血清待檢。棄去溶血、脂血標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)且患者知情同意。

1.2 試劑與儀器

多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒(上海透景生命科技有限公司)，羅氏試劑盒(瑞士羅氏公司提供)、所用校準(zhǔn)品、質(zhì)控品均為各試劑盒原裝配套；Luminex多功能流式點(diǎn)陣儀(美國(guó)Luminex公司)、全自動(dòng)流式熒光發(fā)光免疫分析儀(Tesmi F3999)羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)儀(Cobas e411Roche 公司，瑞士))、臺(tái)式低俗自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京時(shí)代北利DT5-2) 。

1.3 評(píng)價(jià)方法

按照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)評(píng)價(jià)方案，在Luminex多功能流式點(diǎn)陣儀上評(píng)價(jià)本法的精密度、準(zhǔn)確度(回歸實(shí)驗(yàn))、檢出限，并分析本法與電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。t檢驗(yàn)和回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)選取上海透景腫瘤標(biāo)志物質(zhì)控品作為檢測(cè)標(biāo)本，批號(hào)180601、180602。批內(nèi)選取質(zhì)控品各1份，各連續(xù)測(cè)定30次。批間選取質(zhì)控品個(gè)1份，連續(xù)測(cè)定30天，每天測(cè)定1次。根據(jù)變異系數(shù)公式：C·V =(標(biāo)準(zhǔn)偏差SD /平均值Mean )× 100%，計(jì)算得知CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的批內(nèi)變異系數(shù)(CV)均<10%，批間變異系數(shù)(CV)均<13%，見(jiàn)表1、表2。由結(jié)果可知，4種腫瘤標(biāo)志物的批內(nèi)及批間變異系數(shù)均較低，表明試劑在多次重復(fù)一次測(cè)定及多次測(cè)定中均有較高的重復(fù)性，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度及精密度高。

表1 流式熒光發(fā)光法精密度實(shí)驗(yàn)批內(nèi)結(jié)果

表2 流式熒光發(fā)光法精密度實(shí)驗(yàn)批間結(jié)果

2.2 最低檢出限的測(cè)定

檢出限，是分析測(cè)定的重要指標(biāo)之一，其對(duì)儀器的性能評(píng)價(jià)及方法建立都是重要的參數(shù)之一，本實(shí)驗(yàn)將零號(hào)校準(zhǔn)品作為空白對(duì)照，重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算平均值(X)與標(biāo)準(zhǔn)差(SD),以x±2s熒光信號(hào)值時(shí)對(duì)應(yīng)的指標(biāo)濃度作為各指標(biāo)的最低檢測(cè)限。CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的最低檢出限值分別為0.5 ng/ml，10 u/ml,1 ng/ml和2 ng/ml。

2.3 流式熒光發(fā)光法參考區(qū)間的測(cè)定

利用流式熒光發(fā)光法測(cè)定一定數(shù)量的正常臨床樣本(n=300)的血清CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的表達(dá)水平，考慮到臨床檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法種類(lèi)繁多，各檢測(cè)方法之間略有差異，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)百分位數(shù)法及結(jié)合經(jīng)典文獻(xiàn)中的推薦值，建立4種腫瘤標(biāo)志物的參考區(qū)間(表3)。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)(Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)) 后，數(shù)據(jù)均呈非正態(tài)性分布。因此，采用百分位數(shù)法建立3 項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的參考區(qū)間。表3所列為第95 百分位數(shù)(P95) 和第99 百分位數(shù)(P99) 的數(shù)值，以各標(biāo)志物的P95作為參考區(qū)間的上限(臨界值)。

表3 腫瘤標(biāo)志物臨床推薦參考值

2.4 不同檢測(cè)方法相關(guān)性的測(cè)定

選取40例臨床樣本，分別采用不同檢測(cè)方法對(duì)CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)，其線(xiàn)性方程如圖1所示，結(jié)果列表見(jiàn)表4。結(jié)果顯示：透景試劑盒利用流式熒光發(fā)光法檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)出的數(shù)據(jù)相關(guān)性良好(r>0.980)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用Luminex多功能流式點(diǎn)陣儀，將多種不同熒光編碼的微球上分別以共價(jià)方式交聯(lián)針對(duì)CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE這4種腫瘤標(biāo)志物的單克隆抗體，并以一定數(shù)量混合,有效地提高了臨床檢測(cè)效率，顯著地降低了醫(yī)療成本。血清中各種腫瘤標(biāo)志物會(huì)被對(duì)應(yīng)的微球捕獲，然后加入生物素標(biāo)記的針對(duì)上述各種腫瘤標(biāo)志物配對(duì)的抗體及鏈親和素標(biāo)記的PE混合物[10]，以形成一種抗體-腫瘤標(biāo)志物抗原-生物素標(biāo)記的配對(duì)抗體-鏈親和素標(biāo)記PE(藻紅蛋白)的混合物，從而通過(guò)多功能流式點(diǎn)陣儀判定出腫瘤標(biāo)志物的種類(lèi)及濃度，具有通量高、配套試劑多、應(yīng)用領(lǐng)域廣、重復(fù)性好、既能檢測(cè)蛋白質(zhì)又能檢測(cè)核酸等優(yōu)點(diǎn)[11-13]。

本研究評(píng)估了流式熒光發(fā)光法檢測(cè)CEA、CYFRA21-1、CA125及NSE四種腫瘤標(biāo)志物的精密度，由于FFA法對(duì)每種檢測(cè)指標(biāo)最少進(jìn)行100個(gè)微球的計(jì)數(shù)后取其平均值，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析上相當(dāng)于對(duì)每個(gè)樣本額外重復(fù)了百次檢測(cè)，從而保證檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性。由結(jié)果可知，批內(nèi)CV均<10%，批間CV均<13%，表明本法精密度較高。CEA、CA125、CYFRA21-1及NSE的最低檢出限值分別為0.5 ng/ml，10 u/ml,1 ng/ml和2 ng/ml，提示FFA法有較好的靈敏度。作者進(jìn)一步以常規(guī)健康體檢患者血清水平的第95百分位數(shù)為參考區(qū)間上限，初步建立FFA法的CEA、CYFRA21-1、CA125和NSE的參考區(qū)間上限。最后，以金標(biāo)準(zhǔn)ECLIA為參考方法，通過(guò)與化學(xué)發(fā)光法比對(duì)試驗(yàn)得知((rCEA) = 0.98917,(rCA125) = 0.99523,(r CYFRA21-1) = 0.99978,(rNSE) =0.99059)，表明兩種方法檢測(cè)血清 CEA、CYFRA21-1、CA125和NSE具有較高的一致性及相關(guān)性。

綜上所述，F(xiàn)FA檢測(cè) CEA、CYFRA21-1、CA125和NSE四種腫瘤標(biāo)志物，僅需10 μl患者血清樣本，45 min便可得出結(jié)果，有效地提高了臨床檢測(cè)效率，可廣泛應(yīng)用于急診患者的快速篩查。流式熒光發(fā)光法與常規(guī)免疫分析方法相比，具有靈敏度高，精密度好，檢測(cè)時(shí)間短，樣本用量少，醫(yī)療成本低等優(yōu)勢(shì)，值得臨床推廣。