糞腸球菌分子分型特點(diǎn)及其與泰利霉素敏感性的關(guān)系

黃 震，胥志超，張 波，王紅燕，陳 重，白 冰，潘偉光，李桂秋，徐廣健，余治健，鄧啟文，李多云

(1. 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院感染科及內(nèi)源性感染診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518052； 2. 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院肺科門診,廣東 深圳 518101； 3. 深圳市醫(yī)院感染質(zhì)量控制中心，廣東 深圳 518052)

糞腸球菌是腸球菌最常見的菌種，作為一種條件致病菌可引起泌尿道感染、傷口感染、腹腔內(nèi)感染、感染性心內(nèi)膜炎及血流感染等[1]，其耐藥機(jī)制復(fù)雜且可水平傳播，給醫(yī)院感染控制工作帶來挑戰(zhàn)。糞腸球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺-鏈陽霉素B (MLSB)耐藥比較普遍[2-3]，此與甲基化酶改變23S rRNA上的V區(qū)藥物作用靶位(A2058)有關(guān)，而最常見的甲基化酶基因?yàn)閑rmB[4-5]。泰利霉素作為酮內(nèi)酯類抗生素的代表性藥物，是首個(gè)獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用的酮內(nèi)酯類抗生素[6]，較MLSB多一個(gè)作用位點(diǎn)(II區(qū)A752)，其與rRNA結(jié)合更牢固，從而抵消部分甲基化酶的作用[7]。目前，國內(nèi)暫未發(fā)現(xiàn)泰利霉素用于抗臨床分離糞腸球菌研究的相關(guān)報(bào)道。多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST)技術(shù)是用于分析細(xì)菌系統(tǒng)性進(jìn)化同源性的重要工具，不同地區(qū)分布的優(yōu)勢(shì)ST型不同，其耐藥特性也不同[8]。本研究采用MLST分析糞腸球菌同源性情況，探討不同基因分型的糞腸球菌中ermB基因分布情況及對(duì)泰利霉素敏感性的差異，為控制其醫(yī)院傳播提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 菌株及來源 320株糞腸球菌分離自深圳市南山醫(yī)院2010—2016年住院患者臨床標(biāo)本，標(biāo)本來源為尿139株(43.4%)，創(chuàng)口分泌物57株(17.8%)，血32株(10.0%)，膽汁27株(8.4%)，其他部位(胸腔積液、腹腔積液、膿液、痰、滲出液、組織塊、引流液、羊水、導(dǎo)管等)共65株(20.3%)。

1.2 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國梅里埃公司)鑒定，采用2016年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定所有藥物最低抑菌濃度(MIC)值，主要藥物包括紅霉素、泰利霉素、氨芐西林、萬古霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、多西環(huán)素和利福平，以糞腸球菌ATCC 29212作為質(zhì)控菌株。泰利霉素的折點(diǎn)參考2016年CLSI推薦對(duì)金黃色葡萄球菌折點(diǎn)：敏感(≤1 μg/mL)，中介(2 μg/mL)，耐藥(≥4 μg/mL )。

1.3 基因組DNA提取與純化 采用DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒按照革蘭陽性菌操作流程提取細(xì)菌基因組DNA，提取的DNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 耐藥基因ermB檢測(cè) 耐藥基因ermB引物：erm(B)-F：CCGTTTACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGC；erm(B)-R：GAATCGAGACTTGAG-TGTGC，由北京六合華大基因公司合成。ermB基因PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物(359 bp)于4 ℃保存。產(chǎn)物隨機(jī)提取純化后測(cè)序，比對(duì)后確定為目的基因。

1.5 MLST PCR擴(kuò)增糞腸球菌7對(duì)管家基因(gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt和yiqL)，其引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照MLST網(wǎng)站(http://efaecalis.mlst.net/misc/info.asp)，PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交MLST網(wǎng)站(http://mlst.net)比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫中的糞腸球菌相應(yīng)基因的等位基因進(jìn)行比較，最終確定糞腸球菌分離株的ST型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 9.45進(jìn)行分析，所有耐藥率數(shù)據(jù)精確到小數(shù)點(diǎn)后一位，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理中耐藥率的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌的耐藥率 糞腸球菌對(duì)泰利霉素中介26株，耐藥138株，耐藥率達(dá)51.3%，對(duì)紅霉素耐藥率高達(dá)95.6%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=161.92，P<0.001)。見表1。對(duì)利奈唑胺、萬古霉素、呋喃妥因、氨芐西林耐藥率分別為15.6%、0.6%、2.2%、0.6%，對(duì)多西環(huán)素、利福平及環(huán)丙沙星耐藥率分別為85.9%、95.3%和38.4%。

2.2 MLST及ermB基因的分布 320株糞腸球菌中，207株(64.7%)ermB基因陽性，分為48個(gè)ST型，56株菌屬于MLST數(shù)據(jù)庫中未記載的新ST分型(NT)，優(yōu)勢(shì)菌株為ST16、ST179和ST30。ST16型 85株(26.6%)，其中72株(84.7%)ermB陽性，對(duì)泰利霉素敏感29株(34.1%)，耐藥56株(65.9%)；ST179型80株，其中71株ermB陽性，對(duì)泰利霉素敏感15株(18.8%)，耐藥65株(81.3%)；ST30型13株(4.1%)，其中8株ermB陽性，對(duì)泰利霉素敏感11株(84.6%)，耐藥2株(15.4%)；其余ST型142株，56株攜帶ermB基因，對(duì)泰利霉素耐藥41株(28.9%)。不同MLST糞腸球菌對(duì)紅霉素及泰利霉素的MIC值及ermB基因攜帶情況見表2。

表1320株糞腸球菌對(duì)泰利霉素及紅霉素的藥敏結(jié)果 (株)

Table1Antimicrobial susceptibility of 320 strains ofE.faecalisto telithromycin and erythromycin(No.of isolates)

抗菌藥物SIR泰利霉素15626138紅霉素1456250

S:敏感 I：中介 R：耐藥

表2 不同MLST糞腸球菌對(duì)紅霉素及泰利霉素的MIC值及ermB基因攜帶情況

紅霉素折點(diǎn)：S≤0.5 μg/mL，I 1～4 μg/mL，R≥8 μg/mL;泰利霉素折點(diǎn): S≤1 μg/mL，I 2 μg/mL，R≥4 μg/mL

2.3 不同MLST及是否攜帶ermB基因糞腸球菌對(duì)紅霉素及泰利霉素的藥敏結(jié)果 比較優(yōu)勢(shì)亞型ST16、ST179和ST30型及其他ST型別糞腸球菌對(duì)紅霉素及泰利霉素的藥敏結(jié)果，經(jīng)χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同ST亞型糞腸球菌對(duì)紅霉素及泰利霉素的藥敏結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表3。ermB陽性的糞腸球菌對(duì)紅霉素與泰利霉素的敏感率均低于ermB陰性組(均P<0.001)，見表4。

表3 不同MLST糞腸球菌對(duì)紅霉素及泰利霉素的藥敏結(jié)果比較

表4 是否攜帶ermB基因糞腸球菌對(duì)紅霉素及泰利霉素的藥敏結(jié)果比較

3 討論

糞腸球菌是人類腸道常見的共生菌，也是導(dǎo)致各種醫(yī)院感染常見的病原體。糞腸球菌對(duì)多種抗菌藥物天然耐藥，且可通過轉(zhuǎn)座子等獲得耐藥基因，使耐藥屬性在細(xì)菌間水平傳播，給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)[9]。隨著大環(huán)內(nèi)酯藥物在臨床上的廣泛使用，腸球菌屬對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥較嚴(yán)重[9]。世界范圍內(nèi)已有多項(xiàng)研究將酮內(nèi)酯泰利霉素用于治療糞腸球菌感染，其效果均優(yōu)于第一、二代大環(huán)內(nèi)酯類藥物[10-11]。本研究結(jié)果顯示，糞腸球菌對(duì)泰利霉素總耐藥率達(dá)51.3%，高于文獻(xiàn)[10-11]研究，但低于對(duì)紅霉素的耐藥率(泰利霉素對(duì)糞腸球菌的抗菌效果優(yōu)于紅霉素)。本研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌對(duì)常用抗陽性球菌藥物萬古霉素、呋喃妥因、氨芐西林均保持高敏感性，但對(duì)利奈唑胺的耐藥性高達(dá)15.6%，高于其他研究[12]報(bào)道；同時(shí)，糞腸球菌對(duì)多西環(huán)素、利福平均保持高耐藥性。故臨床上糞腸球菌感染應(yīng)多選用氨芐西林、萬古霉素、呋喃妥因或利奈唑胺。

采用MLST分析發(fā)現(xiàn)，該院糞腸球菌可分為48個(gè)ST型和56株MLST數(shù)據(jù)庫未登記的ST型(NT)，ST16和ST179為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，其同屬CC16克隆復(fù)合群(Clonal complex)，其次為ST30、ST28及ST11等。ST16和ST179較其他ST型對(duì)泰利霉素的敏感性亦較差，耐藥率分別達(dá)65.9%、81.3%。檢測(cè)耐藥基因ermB，發(fā)現(xiàn)在ST16和

ST179型糞腸球菌中ermB基因的陽性率較高，分別為84.7%、88.8%，耐藥基因ermB的存在對(duì)降低泰利霉素的敏感性起重要作用。

目前，國內(nèi)外已有多個(gè)報(bào)道對(duì)臨床及環(huán)境分離的糞腸球菌MLST及特征進(jìn)行研究。李巖等[13]在遼寧某醫(yī)院分離的優(yōu)勢(shì)菌群亦為ST16、ST179，且其毒力基因cylA、gelE、esp和asa1攜帶率在70%以上。研究[14-15]表明，ST16還具有更容易形成強(qiáng)生物膜和更高的特地唑胺(tedizolid)耐藥率等特性。國外糞腸球菌MLST相關(guān)研究亦顯示CC2、 CC16、CC21、CC30、CC40及 CC87是世界范圍內(nèi)播散的優(yōu)勢(shì)菌株[16]，上述克隆群在本院亦有發(fā)現(xiàn)，而Ruiz-Garbajosa等研究[17]更是將ST16描述為“適應(yīng)醫(yī)院的菌群之一”，意味著ST16更容易產(chǎn)生多重耐藥。該院糞腸球菌以ST16和ST179為主，且標(biāo)本來源以尿、創(chuàng)口分泌物為主，尿路的侵入性操作或?qū)Ч艿氖褂迷黾印o菌意識(shí)薄弱、傷口處理不當(dāng)均有導(dǎo)致其流行的可能，在臨床治療中也應(yīng)根據(jù)CC16的特點(diǎn)合理選用抗菌藥物。

糞腸球菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜，本研究仍存在局限性。erm基因有數(shù)十種亞型，糞腸球菌主要攜帶ermB基因，本研究僅對(duì)ermB基因攜帶情況進(jìn)行研究，亦不排除其他erm基因同時(shí)存在并引起泰利霉素耐藥的可能。本院MLST以ST16及ST179分型為主，ermB的高攜帶率僅是紅霉素、泰利霉素高耐藥率機(jī)制之一，其他機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。