不同連作年限烤煙根際土壤真菌群落18S rDNA-PCR-DGGE分析

許自成，王發展，金伊楠，王蒙蒙，熊亞南，郝浩浩，許曉敬

（1．河南農業大學煙草學院，河南 鄭州 450002；2．河南省煙草公司駐馬店市公司，河南 駐馬店 463000）

烤煙為忌連作作物，但我國烤煙連作現象普遍存在，導致煙株生長發育不良，抗病抗逆能力降低，煙葉產質量下降，嚴重影響煙葉生產可持續發展［1-4］。土壤微生物對環境改變和脅迫的反應非常敏感［5］，并在土壤內部的變化過程中扮演著重要的角色，因此根際微生物活動是研究烤煙連作障礙的又一重要突破口。近些年來，越來越多的學者認為根際微生態失調可能是連作障礙發生的主要原因并進行大量研究。古戰朝等［6］研究發現，根際土壤中細菌的數量隨連作年限的增加大致呈“升－降－升－降”的趨勢，并跟隨烤煙連作年數的延長，根際土壤中細菌所占比例顯著降低，真菌比例顯著增加，放線菌比例變化則無明顯規律。符建國等［7］認為連作造成土壤的理化性質惡化并使植物根系分泌化學物質產生自毒作用，這影響了土壤微生物群落的多樣性。羅文富等［8］通過對云南煙區煙草疫霉的研究，認為連作煙田病菌密度高于輪作煙田，可能是隨著連作年限的增加，細菌的數量減少，真菌的數量增加。但是，目前有關連作植煙土壤微生物多樣性的研究大多集中在連作對土壤微生物數量和細菌群落結構的影響方面［9-12］，針對不同連作年限對烤煙根際土壤真菌群落結構的影響的研究較為有限。而且，多數研究主要采用傳統微生物平板培養法，利用分子生物學手段較少［13］。平板培養法能較為直觀地統計微生物的數量，但只能反映極少數微生物的信息［14］。因此，本研究以河南漯河煙區為例，采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術并結合真菌的18S rDNA基因測序研究不同連作年限對烤煙根際土壤真菌群落結構和多樣性的影響，以期揭示連作植煙土壤微生物群落多樣性與結構變化特征，為進一步完善烤煙連作障礙理論提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況及樣品采集

試驗于2014年在河南省漯河市郾城區烤煙生產基地（東經114°00′，北緯33°58′）進行。供試烤煙品種為豫煙10號，由漯河市煙草公司提供。該地區植煙土壤為淋溶性黃褐土，土壤基礎養分含量為有機質8.12～11.31 g/kg，pH值 7.62～7.83，堿解氮72.6～80.3mg/kg，有效磷15.4～26.1 mg/kg，速效鉀113.2～169.5mg/kg。年均氣溫為14.7℃，年均日照時數2181h，全年無霜期為216～225d，年均降水量為786mm。

試驗設3個處理，分別為烤煙輪作（前茬為玉米）、烤煙連作3年和烤煙連作6年。采用大區對比設計進行比較，每個處理面積為2 000 m2，種煙行距、株距分別為110、60 cm。各處理采用“S”型采集法，分別在烤煙團棵、旺長、成熟3個時期，在近株距10cm處，采集0～20cm土壤，重復多次混勻，剔除碎石子及植物殘體等，用無菌袋保存于-80℃帶回實驗室，用于DGGE的測定分析。土壤編號分別為Ⅰ-V1（輪作團棵期）、Ⅰ-V2（連作3年團棵期）、Ⅰ-V3（連作6年團棵期）、Ⅱ-V1（輪作旺長期）、Ⅱ-V2（連作3年旺長期）、Ⅱ-V3（連作6年旺長期）、Ⅲ-V1（輪作成熟期）、Ⅲ-V2（連作3年成熟期）和Ⅲ-V3（連作6年成熟期）。

1.2 真菌DGGE的分析測試

1.2.1 真菌基因組DNA的提取及PCR擴增

本實驗土壤總DNA提取采用美國MP Biomedicals生物醫學公司生產的FastDNATMSPIN Kit For Soil，提取方法按試劑盒使用說明進行操作。以樣品總DNA為模板，采用北京博友順生物技術有限公司提供的特異性引物GC-Fung（CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CAT TCC CCG TTA CCC GTT G）/NS1（GTA GTC ATA TGC TFG TCT C）進行擴增［15］。PCR 采用 50μL 反應體系:10× PCR buffer 5μL；dNTP（2.5 mmol/L）3.2μL；rTaq（5U/μL）0.4μL；真菌用 GC-Fung（20 mmol/L）1μL；NS1（20mmol/L）1μL，模板DNA 100 ng；補ddH2O至50μL。PCR擴增程序為:真菌為94℃預變性5min；94℃變性30s、55℃復性30s、72℃延伸30s、30個循環；最終72℃延伸10min。

PCR產物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收，PCR儀為Biometra公司生產的T-gradient，凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統。

1.2.2 PCR產物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析

取10μLPCR的產物進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析［16］，真菌采用變性梯度為25%～40%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液［17］中150V 60℃下電泳8h。變性梯度凝膠電泳（DGGE）完畢后，采用銀染法［18］染色。

1.2.3 DGGE圖譜中優勢條帶的回收與測序

用滅菌的手術刀切下待回收DGGE條帶，采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶，以2μL回收產物為模板，以不帶GC夾子的引物進行PCR擴增［19］。

將重新擴增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到pMD18-T載體上，并轉化至DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，菌液由華大基因對插入的真菌18S rDNA片段進行序列測定。

1.2.4 序列分析

將測序所得的真菌18S rDNA優勢菌的序列提交至NCBI的GenBank數據庫，在GenBank中使用Blast程序進行同源性比較，獲得最相似典型菌株的18S rDNA序列。

1.3 統計分析方法

DGGE條帶采用Quantity One軟件分析；Redundancy analysis（RDA）采用CANOCO 5.0軟件進行；圖表繪制及數據的整理在Excel 2007軟件上進行。

2 結果與分析

2.1 真菌DGGE圖譜分析

所得18S rDNA片段通過變性梯度凝膠電泳技術能分離長度相同而堿基組成不同的DNA序列（圖1），可以看到明顯分離的條帶有24條，且多數條帶為每個泳道所共有，說明這些處理土壤中大多數真菌類型是共有的。條帶位置和數目存在一定差異，說明存在特有的真菌類型。此外，這些公共條帶的亮度也有差異，說明土壤真菌在DNA水平上有明顯的改變并且真菌種群間的協同演替機制受連作影響。運用Quantity One軟件對圖譜進行基本的背景排除，經過泳道、條帶識別以及配對等步驟得到電泳虛擬圖（圖2），可以更加直觀的看出每個樣品的條帶差異情況。從條帶數量上看，各處理土壤均表現為成熟期＞旺長期＞團棵期，可見烤煙生育中后期土壤真菌群落結構組成比較復雜。此外，隨著生育期的推移，連作的真菌群落變化較輪作明顯，且連作6年的變化程度大于連作3年，由此可知不同連作年限對烤煙根際土壤真菌群落有較大影響。

圖1 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌DNA圖譜

圖2 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌DNA電泳虛擬圖

2.2 真菌群落相似性指數分析與聚類分析

運用Quantity One 軟件對 DGGE 圖譜做相似性分析，得到不同處理真菌群落相似性指數（表1）。結果顯示，整體上各樣品間相似性指數均處于較低水平，表明輪作與連作土壤的真菌群落結構有較大差異，且隨著連作年限的延長，相似性是降低的，這說明連作對土壤真菌群落的功能多樣性有影響，且隨著連作年限的增加影響越大，這與真菌DGGE圖譜分析的結果一致。

表1 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌群落相似性指數

基于各樣本DGGE條帶的位置、數量和亮度，采用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行UPGMA聚類分析，見圖3。所有樣品真菌群落按相似程度可以分為5類，輪作土壤旺長期、連作6年和連作3年的成熟期的真菌群落（Ⅱ-V1、Ⅲ-V3、Ⅲ-V2）能較好聚成一類，連作3年團棵期、連作6年團棵期以及連作3年的旺長期的真菌群落（Ⅰ-V2、Ⅰ-V3、Ⅱ-V2）聚為一類，輪作的團棵期（Ⅰ-V1）、連作6年的旺長期（Ⅱ-V3）、輪作的成熟期（Ⅲ-V1）真菌群落各自為一類，這同樣說明連作較大程度地改變了土壤真菌的遺傳多樣性，且不同時期對真菌群落有較大影響。

圖3 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌群落聚類分析

2.3 真菌群落多樣性比較

表2所示，真菌多樣性指數在幾個樣品之間都有所差別。從豐度（S）來看，整體上成熟期＞旺長期＞團棵期，連作6年＞輪作＞連作3年。對于均勻度（E），在團棵期，連作6年＞連作3年＞輪作；在旺長期，輪作＞連作3年＞連作6年；在成熟期，連作6年＞輪作＞連作3年，其中最大值出現在連作6年的團棵期，各土壤樣品E值有一定差別，也說明了連作改變了真菌群落結構。從香濃指數（H）和辛普森指數來看，整體上各土壤樣品在旺長期和成熟期真菌多樣性較高，同時期連作6年土壤樣品真菌多樣性均大于輪作與連作3年土壤，與豐度結果一致。

表2 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌多樣性指標

2.4 DGGE條帶回收序列分析

真菌條帶測序后經NCBI比對得到表3。結果表明，從9個樣品的DGGE圖譜中成功回收的24個條帶與數據庫中的模式菌株都具有一定的同源性，且相似度在92%～100%，多數與已知菌種的相似度高達97%～100%。一般認為序列同源性小于98%，屬于不同種的真菌，同源性小于93%～95%，則屬于不同的屬［20-21］。因此可以認為真菌菌群優勢菌為角擔菌科（Ceratobasidiaceae）的立枯菌絲核菌（Rhizoctonia solani）和煙草靶斑病（Thanatephorus cucumeris）、盤菌科（Rhizoctonia）、被孢霉科（Mortierellaceae）、鐮刀菌屬（Fusarium）、生赤殼科（Bionectriaceae）、漆斑菌屬（Myrothecium）、傘菌科（Agaricaceae）、鏈格孢屬（Alternaria）、球蓋菇科（Strophariaceae）、炭角菌目（Xylariomycetidae）、鏈壺菌科（Lagenidiaceae）、腐霉科（Pythiaceae）、花冠菌屬（Corollospora）、梳霉科（Kickxellaceae）等。

表3 優勢真菌群落的測序克隆序列與其GenBank最相似序列的比對結果

此外，條帶9、12、13、16、18存在于烤煙不同生育時期各連作處理土壤中，但條帶亮度有不同程度差異，說明其所代表的是烤煙連作土壤中土著的真菌優勢種群。而條帶11、20和23的真菌種群是連作3年和連作6年土壤中出現過的，條帶1的真菌種群僅出現在連作3年的土壤樣品中，條帶3、4和15的真菌種群僅出現在連作6年的土壤樣品中，說明不同連作年限造成一些特異菌群的變化，特別是連作3年和連作6年與輪作相比造成了某些特異性真菌的出現。除此之外，不同生育期植煙土壤真菌結構也有一定差異。條帶2只出現于烤煙團棵期的輪作土壤，且亮度清晰可辨，其與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）相似度為99%，可能同屬真菌；盤菌科主要分布在連作6年的土壤中，而盤菌科存在于多腐生與腐殖質豐富的土壤中，少數寄生子囊能夠引起植物的根腐、莖腐、葉斑等，這也說明了隨著連作年限的延長，土壤中病原物質增多。條帶7主要存在輪作和連作3年團棵期煙田，與尖孢鐮刀菌序列的相似性為100%，說明它在輪作各生育期和連作3年團棵期表現出優勢種群；條

帶8主要存在于烤煙成熟期輪作、連作土壤中，而其與煙草靶斑病（Thanatephorus cucumeris）之間存在99%的相似度，可能是由于成熟期陰雨天氣較多，田間相對濕度較大，有利于靶斑病的發生與蔓延［22］。以上分析可見，烤煙連作后土壤的真菌種群結構發生了變化。

2.5 物種環境因子圖

不同連作年限植煙土壤的酶活性和養分含量如表4所示。將不同連作年限植煙土壤的酶活性和養分含量中的土壤蔗糖酶（Invertase）、脲酶（Urease）、堿性磷酸酶（AKP）、蛋白酶（Protease）活性以及土壤堿解氮（AN）、有效磷（AP）、速效鉀（AK）含量與真菌條帶的相關性做RDA物種因子圖（圖4），可以看出，縱軸和橫軸所能解釋的相關變量分別為23.2%和28.1%，分析得知條帶1、2、5、8、10、11、15、19均與速效鉀含量、蛋白酶活性有較強的正相關關系，而與土壤堿解氮含量、堿性磷酸酶活性、脲酶活性、蔗糖酶活性有較強的負相關關系，條帶6、18、24則與之相反，并且條帶3、14、17、21、22均與有效磷含量有較強的正相關關系。這說明條帶5、8、9、15、17、18、19的菌群活動，對土壤的營養代謝影響較大。根據前述分析可知，條帶8、9、15主要存在于連作3年和連作6年的烤煙土壤中，說明烤煙連作后土壤真菌群落結構的變化對土壤的營養代謝有強烈的影響，可能是導致連作后烤煙生長發育受抑的重要原因。

表4 不同連作年限植煙土壤的酶活性和養分含量

圖4 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期優勢真菌物種環境因子圖

3 結論與討論

不同連作年限烤煙根際土壤樣品在經過 DGGE后，分離出數目不等和遷移率存在明顯差異的電泳條帶（圖1），揭示了不同連作年限烤煙各生育期根際土壤真菌群落的差異性。由電泳圖以及多樣性指數均能得出，無論是輪作還是連作烤煙生育中后期植煙土壤真菌群落最為豐富，可能是由于成熟期在8～9月份，高溫高濕條件下真菌的繁殖與活動增強，并且煙株脫落的煙葉、腳葉落入土壤，為真菌提供充足的營養環境，旺長期則是煙株生長發育最強時期，大量根系分泌物的產生也影響了真菌的繁殖生長［23］。齊虹凌等［24］通過研究輪作與連作對烤煙不同生育期根際土壤細菌群落結構的影響，認為生育期是影響烤煙根際細菌群落結構變化的主要因素，而連作與輪作是次要因素。然而就本試驗而言，真菌群落變化對生育期和種植模式的響應程度是否與細菌群落一致尚需進一步地研究。

已有相關研究認為作物連作對土壤真菌群落結構產生了深刻影響［25-26］。本研究的DGGE分析結果表明，不同連作年限烤煙根際土壤樣品條帶數有明顯改變，連作使土壤中真菌種群的個體數明顯增多，一些優勢種群在不同連作年限的土壤中所處的優勢地位發生了很大變化，而且連作6年的變化程度大于連作3年，說明隨著連作年限的增加影響越大，這與何川等［9］的研究結果一致。此外，對回收條帶序列測序結果表明，不同連作年限造成一些特異菌群的變化，如盤菌科僅出現在連作6年的土壤中，能夠引起植物的根腐、莖腐、葉斑等，表明隨著連作年限的延長，土壤中病原物質增多。這可能與連作土壤根系分泌物增多、土壤養分失衡等因素有關［27-28］。關于馬鈴薯連作的研究［19］則表明連作較輪作并未造成馬鈴薯根際土壤真菌種群數量和多樣性的顯著變化，這可能與試驗區生態環境條件及土壤類型有關，直接表現在作物根際的土著微生物的種類，不同種屬或功能型的微生物對連作的敏感性和受性也截然不同；另外還可能與供試作物品種有關，因為其根系分泌物種類和數量均能對根際微生物的活性和組成結構產生影響。有研究表明，連作土壤中某些優勢種群富集絕大部分為鐮刀菌屬等土傳病害真菌，主要通過分泌毒素與細胞壁降解酶導致宿主植物發病，并且隨著連作年限的增加而逐漸成為優勢真菌生理群［29-30］，這與本研究結果并不完全一致。從試驗結果來看，尖孢鐮刀菌屬主要存在輪作和連作3年團棵期煙田，而在連作6年土壤中未顯示。這可能是隨著煙田持續連作，土壤真菌豐富度和多樣性不斷下降，但連作持續一段時間后土壤微生態系統出現恢復或趨于達到一個新的相對穩定狀態，其它真菌群落限制了尖孢鐮刀菌屬的生存［31］。值得注意的是，土壤漆斑菌屬存在于烤煙生長的整個大田期，有研究表明漆斑菌屬廣泛存在于植物和土壤中，而且大都具有很強的纖維素分解能力，部分菌類還能夠產生抗生素［32］，土壤漆斑菌屬的存在可能對連作土壤微生態的自我修復或化學營養環境的改善有重要影響。總的看來，這些微生物在植煙土壤真菌優勢種群平衡中的作用鮮有報道。

微生物群落在土壤有機質分解和營養元素循環中有著至關重要的作用［33］。楊宇虹等［34］指出煙草連作對土壤營養元素循環相關微生物數量有重要影響。土壤微生物群落功能指標與土壤理化性質關系密切，且相互影響。長期連作使土壤的理化性質和生物學性質惡化，導致土壤微生物的多樣性和活性下降，從而降低煙草的產質量和加重煙草田間病害［9］。本研究中RDA物種因子圖結果顯示長期連作導致土壤真菌菌群結構變化，并且煙草靶斑病原與土壤蛋白酶活性有強烈的正相關關系，腐霉科則與土壤速效鉀有強烈的正相關性，鏈壺菌科、生赤殼科的菌群活動與土壤的堿解氮含量、蔗糖酶活性、脲酶活性、堿性磷酸酶活性都有強烈的正相關性，反映了真菌群落與土壤營養元素的關系，但是它們在原位生態環境中的生理生化特性及其所具備的生態功能意義有待進一步的研究。本研究采用的DGGE作為一種分析微生物群落結構組成的分子生物學技術，能夠直觀地比較和分析微生物群落結構的變化規律，定性地比較土壤微生物群落的差異，尤其是優勢微生物類群，但其無法檢測基因組中DNA含量少于1.5%的種群，導致不能反映樣品中部分低豐度菌種，而高通量測序能提供更多關于低豐度細菌類群的信息［35-36］，因此在后續研究中可采用DGGE技術與高通量測序相結合的方法進行，以便能更全面系統地分析不同連作年限土壤樣品中真菌群落差異，從而為完善連作土壤中真菌群落結構提供更加全面、真實的信息。