產(chǎn)香酵母的篩選及其蘋果酒發(fā)酵特性

張俊杰，尚益民，彭姍姍，范雨晴，魏賀坤，尚紫博，范建橋

（鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001）

產(chǎn)香酵母是一類可以產(chǎn)生揮發(fā)性香味化合物的酵母[1-2]。產(chǎn)香功能性微生物的范圍沒有明確的定義，產(chǎn)香酵母除了能夠產(chǎn)生醇類和酯類，還能生成酮類、醛類等化合物，形成多種風味物質(zhì)，在代謝過程中產(chǎn)生多種維生素、氨基酸，還能產(chǎn)生某些生物活性物質(zhì)，增強人體免疫力[3]。

蘋果營養(yǎng)豐富，但蘋果的消費方式主要以鮮果消費為主，消費方式單一導致蘋果出現(xiàn)生產(chǎn)過剩、效益下降的尷尬局面。蘋果酒的口味柔和，兼具蘋果的水果香味，是老少皆宜的佳釀，因此，開發(fā)高品質(zhì)蘋果酒成為蘋果消費的新趨勢。

蘋果酒中的揮發(fā)性香味物質(zhì)成分復雜多樣，已知的有上百種，主要為醇、酯、萜、醛類物質(zhì)等[4-5]。這些香味物質(zhì)有的來源于果實，有的來源于工藝階段。W ILLIAMSA A等[6]采用SweetCoppin的蘋果汁制作蘋果酒，發(fā)現(xiàn)蘋果中固有的揮發(fā)性香味物質(zhì)成分對蘋果酒的香味影響很小。根據(jù)MORTON ID等[7]報道，不同品種蘋果汁發(fā)酵的蘋果酒中，還能被分辨出是蘋果果實香氣的只有金冠等比較典型風味的蘋果品種；其他大部分品種蘋果酒的香氣不能被辨別。尚宏芹[8]綜述了蘋果酒中主要的香氣成分及其來源，并介紹了國內(nèi)外蘋果酒中香氣成分的提取和分析方法，揭示了蘋果酒的香氣成分是構(gòu)成蘋果酒質(zhì)量的重要因素，決定著蘋果酒的風味和典型性。于愛梅等[9-10]研究認為蘋果中的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量對蘋果酒的影響重大。蘋果酒產(chǎn)業(yè)在我國起步相對較晚，生產(chǎn)工藝上不成熟，且發(fā)酵用的菌株來源不明，缺乏安全性和明確性，并且產(chǎn)品同質(zhì)化現(xiàn)象嚴重。因此，開發(fā)安全性高、品質(zhì)好的蘋果酒成為蘋果酒產(chǎn)業(yè)的一個重要研究方向。產(chǎn)香酵母對酒的感官風味有特別的貢獻，但是目前直接應用到低醇果酒生產(chǎn)中的產(chǎn)香酵母菌株仍很匱乏。本實驗從赤霞珠葡萄酒釀造不同時期的發(fā)酵液中分離獲得酵母菌資源，并從中篩選出具有較好產(chǎn)香特性的菌株，研究其對蘋果酒發(fā)酵特性的影響，為該菌株今后的工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

供試菌株：分離自赤霞珠葡萄酒（本實驗室自制，其中赤霞珠葡萄采自鄭州NAPA酒莊）釀造不同時期的發(fā)酵液，共80株酵母菌株，分別編號為S1-1、3、4、8、13，S2-1～5，S3-9、11、13、14、15，S4-10～14，A1-3～7，A2-11、12、13、14、16，A3-4、10、11、14、15，A4-10 ～14，B1-1、2、5、6、7，B2-9、11、12、13、14，B3-1、3、6、11、13，B4-3、5、6、7、8，D1-11、13、18、19、20，D2-1～5，D3-2、3、10、11、12，D4-4、5、6、8、9。其中S、A、B、D對應于發(fā)酵1d、3d、5 d、7 d，下標1～4表示酒樣的四個重復。安琪釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化學試劑

酵母浸粉（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；葡萄糖（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；Ezup柱式基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、26S rDNA D1/D2區(qū)擴增引物NL-1和NL-4以及5.8 ITS區(qū)擴增引物ITS-1和ITS-4：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

YEPD固體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂粉20 g/L，自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化安泰公司；DH-600生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；C1000 TouchTM聚合酶鏈反應（polymerasechain reaction，PCR）擴增儀：美國Bio-Rad公司；JY023紫外分析儀：北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株初篩

將80株供試菌株分別接種到Y(jié)EPD固體培養(yǎng)基中，28℃，避光培養(yǎng)2 d，嗅覺靈敏的人員對揮發(fā)性風味物質(zhì)進行感官評估（通過嗅聞法，依據(jù)所聞到的香味濃郁程度進行初步評估）。

1.3.2 菌株復篩

將經(jīng)過初篩得到的產(chǎn)香濃郁的7菌株進行復篩，分別考察其對酒精、SO2、NaCl耐受性。

酒精耐受性的測定：將菌懸液接種至不同酒精含量（8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol）的YEPD液體培養(yǎng)基（接種量為1%），28℃、180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期（培養(yǎng)24 h），用比濁法判斷菌株酒精耐受性能（比較其在波長600 nm條件下的吸光度值，其值越大，表明耐受性越高，取3組重復的平均值。下同）。

SO2耐受性的測定：將菌懸液接種至不同SO2含量（100mg/m L、120mg/mL、140mg/m L、160mg/mL）的YEPD液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/m in培養(yǎng)至對數(shù)期（培養(yǎng)24 h），用比濁法判斷菌株耐受性能。

NaCl耐受性的測定：將菌懸液接種至不同NaCl含量（0、4%、6%、8%、10%）的YEPD液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/m in培養(yǎng)至對數(shù)期（培養(yǎng)24 h），用比濁法判斷菌株耐受性能[13]。

1.3.3 產(chǎn)香酵母的分子生物學鑒定方法

酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)和5.8S-ITS區(qū)序列的PCR擴增與檢測：采用倪崢飛等[14-15]的實驗方法進行酵母菌株基因組DNA的提取，使用正向引物NL-1和反向引物NL-4擴增26S rDNA D1/D2區(qū)段。使用正向引物ITS1和反向引物ITS4進行5.8S-ITS區(qū)基因擴增[16]，PCR反應體系和程序參見劉愛國等[17]的研究方法，結(jié)果檢測參照張俊杰等[18]的檢測方法。

PCR擴增產(chǎn)物的測序及分類地位的確定：PCR擴增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列結(jié)果用MEGA 7.0軟件進行校正，校正序列在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中局部序列比對基本檢索工具（basic localalignment search tool，BLAST）進行同源序列比對，確定該菌株的分類地位。

1.3.4 蘋果酒加工工藝及操作要點

原料前處理→蘋果榨汁→過濾殘渣→添加菌種→密封發(fā)酵→蘋果酒

操作要點：

將蘋果洗凈去皮，并切為小塊，放入榨汁機中，不加水，直接榨汁。榨汁后的汁液用八層紗布過濾兩次，并對得到的汁液進行糖度的測定，若糖度太低則需要加入葡萄糖調(diào)節(jié)。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的安琪果酒酵母和菌株B2-13按照1%的接種量，在無菌條件下接種至蘋果汁中，并加入10mmol/L亞硫酸氫鈉。蘋果汁液密封，28℃條件下發(fā)酵7 d，當糖度＜5 g/L時，即可終止發(fā)酵，得到蘋果酒。

1.3.5 分析檢測

蘋果酒中殘?zhí)呛康臏y定[20]：采用斐林試劑法測定蘋果酒中殘?zhí)呛浚惶O果酒中可滴定酸含量的測定[20]：采用酸堿滴定法測定蘋果酒中可滴定酸含量；蘋果酒中揮發(fā)性香氣成分的測定：采用同時蒸餾法萃取酒中的香氣成分，并進行氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析[21]。GC-MS條件如下：

氣相色譜（GC）條件：分流方式：不分流；升溫程序：初始溫度40℃，保持3min，然后以3℃/min升至120℃，最后以8℃/min升至230℃；載氣：氦氣（He）；流速：2m L/min；檢測器溫度：230℃，入口溫度：230℃。

質(zhì)譜（MS）條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍33～350 u。將萃取好的針插入GC進樣口，在230℃解吸附5m in[22]。

定性定量分析：蘋果酒香氣成分GC-MS檢測結(jié)果運用計算機檢索并與圖譜庫的標準質(zhì)譜圖對照，結(jié)合有關文獻，確認化學成分，內(nèi)標乙酸苯乙酯（0.668mg/m L）用于定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香菌株初篩結(jié)果分析

80株菌株經(jīng)過初步篩選，有7株供試菌株產(chǎn)香濃郁，分別編號為A2-12、B1-5、B2-12、B2-13、B4-7、S1-8、S2-4，17株菌株產(chǎn)香稍淡，19株菌株產(chǎn)香微弱，而剩余37株菌株幾乎無香味。結(jié)果表明大部分的供試菌株并不具備較好的產(chǎn)香能力。因此，將菌株A2-12、B1-5、B2-12、B2-13、B4-7、S1-8、S2-4進行耐受性測定。

2.2 產(chǎn)香菌株復篩結(jié)果分析

以安琪酵母菌（Angel）為對照，菌株A2-12、B1-5、B2-12、B2-13、B4-7、S1-8、S2-4耐受性（耐SO2、耐NaCl、耐酒精）分析結(jié)果見表1～表3。

表1 菌株SO2耐受性結(jié)果Table 1 Results of SO2 tolerance of strains

由表1可知，8株菌對SO2都有很好的耐受性（在120mg/m L含量下生長基本不受影響，此外在160mg/m L含量下都能有較多的生長量）。其中菌株A2-12、S2-4、B4-7、Angel的耐SO2能力更加優(yōu)異（在160mg/m L含量下，生長幾乎不受影響）；菌株S1-8、B2-13、B1-5、B2-12的耐SO2能力相對較差（在140mg/m L含量下，其生長受到了明顯的抑制，在160mg/m L含量下，生長量更少）。因此，菌株A2-12、S2-4、B4-7、Angel耐受SO2能力更強。

表2 菌株鹽耐受性結(jié)果Table 2 Results of salt tolerance of strains

由表2可知，8個菌株在耐鹽性能均較差。在含鹽量0～8%范圍內(nèi)，隨著含鹽量的增加，8個菌株的吸光度值梯度型減少，在無鹽量條件下，所有菌株的OD600nm值都＞2.0，在含鹽量為8%的條件下，幾乎所有菌株的OD600nm值都降到了1.0以下；其中菌株S2-4的表現(xiàn)優(yōu)異，OD600nm值均大于其他菌株，尤其在含鹽量為8%的時候表現(xiàn)明顯優(yōu)異于其他菌株，OD600nm值＞1.0；菌株B2-12和Angel兩個菌株的耐鹽性能相對較差，在含鹽量為6%的時候比其他6個菌株的表現(xiàn)差，OD600nm值均＜1.0。

表3 菌株酒精耐受性結(jié)果Table 3 Results of alcohol tolerance of strains

由表3可知，8個菌株中Angel的耐酒精能力最強，在酒精度為8%vol和10%vol的表現(xiàn)上遠遠超過其他7個菌株，其他菌株在酒精度為10%vol時的菌株含量已經(jīng)幾乎為零；其中菌株B2-13相較于其他6個菌株在酒精度為8%vol表現(xiàn)優(yōu)異；菌株B2-12相較于其他菌株也表現(xiàn)出了一定的酒精耐受性。

對表1～表3的所有耐受性實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，結(jié)果表明，7株菌和對照組安琪酵母在耐SO2、耐鹽性能方面的差異不顯著（P＞0.05）。但是，在酒精耐受性方面，菌株B2-13相較于其他6個菌株表現(xiàn)優(yōu)異，此外，只有該菌株在酒精度為8%vol時，OD600nm值＞1.0。因此，進一步對菌株B2-13（分離自發(fā)酵5 d的蘋果酒樣）進行鑒定并應用于蘋果酒的發(fā)酵研究。

2.3 菌株鑒定結(jié)果

對菌株B2-13的26S rDNA和5.8S ITS序列進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，菌株B2-13與葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）的相似性達到99%。基于26S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株B2-13與葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）聚于一支，因此，酵母菌株被鑒定為B2-13葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）。

圖1 基于26S rDNA序列菌株B2-13的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain B2-13 based on 26S rDNA sequences

2.4 發(fā)酵蘋果酒香氣成分結(jié)果分析

香氣成分的GC-MS分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，由不同菌種發(fā)酵的蘋果酒中的香氣成分有一定的差異，在由安琪牌果酒酵母發(fā)酵的蘋果酒中，共檢出29種香氣成分，主要有酯類（10種）、醛酮類（僅有呋喃甲醛）、醇類（5種），酸類（9種）等，其中異戊醇、苯乙醇含量最高，分別為0.871mg/m L和0.481mg/m L，其次為癸酸乙酯和十二酸乙酯，分別為0.065mg/m L和0.049mg/mL，另外酸類如辛酸和癸酸分別為0.042mg/m L和0.043mg/m L。其余物質(zhì)含量很低；而在由菌株B2-13發(fā)酵的蘋果酒中，共檢出32種香氣成分，主要有酯類（6種）、醛酮類（4種）、醇類（6種）、酸類（8種）等，其中醇類如異戊醇、苯乙醇含量最高，分別為0.356mg/m L和0.135mg/mL，另外醛酮類3-羥基-2-丁酮的含量為0.160mg/mL，其余含量很低。高級醇、酯類是影響蘋果酒風味的主要成分。綜合以上結(jié)果，與安琪牌果酒酵母相比，由菌株B2-13發(fā)酵的蘋果酒中的香氣成分更多，尤其是醛酮類的香氣成分更多。其次，含有一種特有的香氣成分醛酮類3-羥基-2-丁酮，該香氣成分更多地存在于赤霞珠葡萄酒中，并且與其他葡萄品種相比，是其特有的香氣成分。Hanseniaspora屬的菌株有較好的產(chǎn)香能力，這與趙海霞等[23]的研究結(jié)果較為一致。因此，將菌株B2-13應用蘋果酒的發(fā)酵中，可能賦予其一定的赤霞珠葡萄酒風味，具有一定的推廣應用價值。

圖2 菌株Angle（A）及菌株B2-13（B）發(fā)酵蘋果酒中香氣成分測定結(jié)果Fig.2 Results of the aroma components in cider fermented by strain Angle(A)and strain B2-13(B)

3 結(jié)論

經(jīng)過初步篩選，從80株酵母菌株中篩選得到7株產(chǎn)香濃郁的菌株，對這些菌株進行耐受性分析時，發(fā)現(xiàn)在耐SO2性能、耐鹽性能方面，菌株并無明顯差異，但是在耐酒精能力方面菌株B2-13較突出，該菌株經(jīng)分子生物學鑒定為葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

菌株B2-13發(fā)酵蘋果酒酒精度為4.2%vol～5.5%vol，糖度為2.6～44 g/L，共鑒定出32種香氣成分，主要有酯類（6種）、醛酮類（4種）、醇類（6種）、酸類（8種）等，其中異戊醇、苯乙醇含量最高，分別為0.356mg/m L和0.135mg/m L，另外還有赤霞珠干紅葡萄酒的特有香氣物質(zhì)3-羥基-2-丁酮（0.16mg/m L）。菌株B2-13是一株具有較好的蘋果酒發(fā)酵和產(chǎn)香性能的酵母菌株，有良好的工業(yè)化生產(chǎn)應用前景。