沙蟹汁發酵過程中微生物與理化成分動態變化分析

陳蕾蕾，劉喚明*，鄧楚津，周春霞，洪鵬志，楊 萍

（廣東海洋大學 食品科技學院 廣東省現代農業科技創新中心 廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088）

沙蟹汁是北海特有的傳統美食，是以沿海灘涂野生沙蟹為原料，通過天然發酵的方法制成的一款純天然、無任何添加劑的綠色食品。該產品有兩百多年的歷史，具有味道鮮美、口感醇厚等特點，深受沿海地區消費者喜愛。“沙蟹汁燜豆角”、“沙蟹汁蘸白切雞”、“沙蟹汁蘸白灼蝦”等北海特色名菜都是以沙蟹汁為調味料制作而成的。沙蟹汁的生產還是傳統的手工工藝，存在質量不穩定、腥味重、色澤差等問題，另外沙蟹汁的核心發酵機制尚不明確。要對其質量進行改善，必須先明確其發酵機制。目前對沙蟹汁報道較少，劉天天等[1]利用分子感官科學技術對沙蟹汁風味行了分析；梁中永[2]對沙蟹汁中的不良風味物質進行檢測及去除研究，尚少見對沙蟹汁發酵過程中微生物的分析進行報道。

目前，對發酵魚露、發酵魚、發酵豆制品等發酵食品中微生物的研究已有所報道，并通過對微生物的分析，對傳統發酵工藝進行改進提供了一定的理論基礎；如黃紫燕等[3]對傳統魚露發酵過程中的微生物進行了分析，并通過外加微生物對魚露的發酵工藝進行了改進[4]。齊寧利等[5]利用分子生物學高通量測序對江洪魚露發酵過程中微生物菌相組成進行分析，發現乳酸菌和酵母菌為魚露發酵過程中的優勢菌。朱雯娟等[6]對梅香魚發酵過程中的微生物進行篩選，并確定發酵菌株為木糖葡萄球菌（Staphylococ-cusxylosus）、嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcushalophilus）及腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus），利用發酵菌株對梅香魚進行發酵，更好的改善了魚制品的品質。許家威等[7]研究了腐乳前酵期微生物與理化指標之間的聯系，為工業化生產腐乳提供了一定的理論依據。

本實驗利用傳統發酵工藝制備沙蟹汁，研究發酵過程中不同階段微生物的變化，檢測總氮、氨基酸態氮、揮發性鹽基氮、游離氨基酸等理化指標，將理化指標與微生物的變化結合分析，試圖找出微生物與理化指標之間的關系，明確微生物的作用，探討沙蟹汁發酵機理，為沙蟹汁的工藝改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙蟹、姜、海鹽：市售；營養瓊脂（nutrientagar，NA）培養基：北京陸橋技術股份有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、碳酸鉀、阿拉伯膠、甘油、甲基紅指示劑、次甲基藍指示劑、甲醇、鹽酸、甲醛（36%）、硫酸（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；細菌通用引物27F、1492R：生工生物工程（上海）有限公司；M ightyAmp脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、2×M ightyAmp Buffer：大連Takara公司。

1.2 儀器與設備

SPX-150B-Z型生化培養箱、SW-CJ-2F型潔凈工作臺：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；JB-1B型磁力攪拌器、PHS-3C型pH計：上海雷磁儀器有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀：珠海黑馬醫學儀器有限公司；Vapodest450全自動凱氏定氮儀：德國格哈特（Gerhardt）分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙蟹汁的制作

新鮮沙蟹清洗、去腸，瀝干至無水流下為止，沙蟹5 kg、姜300 g，一起搗碎，加入2 kg海鹽，攪勻，繼續搗碎，加入3 L涼開水，攪勻，裝缸，封存，25℃發酵15 d，即為沙蟹汁。

1.3.2 微生物檢測

按照傳統工藝制備沙蟹汁，每隔3 d在無菌環境中取發酵液進行分析。取樣前，將沙蟹汁混勻，于4 000 r/min離心10m in后取上清液，梯度稀釋后選取3個合適的稀釋度涂布于營養瓊脂培養基，25℃培養48 h，選取菌落數在30～300之間平板計數，1個稀釋度選擇3個平板。根據菌落形態挑取不同的菌，劃線分離純化至鏡檢觀察為純培養物，斜面保存。

1.3.3 微生物的16S rDNA鑒定

分離微生物的鑒定利用27F和1492R細菌通用引物作為正反向引物，利用M ightyAmp DNA Polymerase進行細菌菌落聚合酶鏈式反應（PCR）擴增[8]。PCR擴增體系：27 F 1.5μL，1492R 1.5μL，M ightyAmp DNA Polymerase 1.5μL，2×M ightyAmp Buffer 30μL，雙蒸水（ddH2O）25.5μL，擴增條件：98℃（預變性）2min，98℃（變性）10 s，55℃（復性）15 s，68℃（延伸）90 s，72℃延伸10min，從變性到第一次延伸這個過程循環40次[6]，將PCR產物送至上海生工公司測序，將測序結果利用BLAST搜索程序從GenBank進行同源性檢索，并下載相似性高的模式菌株的16S rDNA基因序列進行分析。

1.3.4 理化指標測定

總氮含量的測定：采用凱氏定氮法[9]；氨基酸態氮含量的測定：參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》甲醛滴定法[10]；揮發性鹽基氮含量的測定：參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》康維皿法（微量擴散法）[11]；氨基酸含量的測定：參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》[12]。

1.3.5 數據分析

采用Excel2016及Origin 8.0對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離純化及鑒定

本實驗采用傳統培養法從不同發酵時間的沙蟹汁分離出5種微生物，將5種微生物的16S rDNA序列，經BLAST在線比對得出相似菌株，5種微生物菌落形態及相似菌株如表1所示。

表1 5種微生物菌落形態及16S rDNA序列比對結果Table 1 Comparison results of colony morphology and 16S rDNA of 5 m icroorganisms

由表1可知，沙蟹汁發酵過程中主要有5種微生物，分別是馬胃葡萄球菌（Staphylococcusequorum subsp.）、阿爾萊特葡萄球菌（Staphylococcusarlettae）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、解淀粉鹽水球菌（Salinicoccus amy-lolyticus）及蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）。馬胃葡萄球菌在發酵產品中已有報道，吳麗紅[13]在川香味香腸腌制、自然發酵、烘烤和經真空包裝后保藏過程中分離出馬胃葡萄球菌，馬胃葡萄球菌為整個過程中的優勢菌；陳學云等[14]從鹽干帶魚中分離出3株馬胃葡萄球菌，3株腐生葡萄球菌；李欣等[15]從錦州蝦醬中分離產蛋白酶嗜鹽菌，分離得到4株馬胃葡萄球菌，證明馬胃葡萄球菌具有產蛋白酶能力；謝科[16]利用傳統培養技術、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradientgel electrophoresis，PCR-DGGE）指紋圖譜分析得到，阿爾萊特葡萄球菌為廣式臘腸發酵過程中的優勢菌群之一。李丙超等[17]對傳統發酵香腸中菌種進行了分子生物學鑒定，指出腐生葡萄球菌含量比較豐富。發酵產品中對解淀粉鹽水球菌的報道較少，SRINIVASA等[18]從鹽地里分離得到一株解淀粉鹽水球菌，并對其特性進行研究表明，該菌株最適生長鹽度為25%，沙蟹汁鹽度為24%，適合解淀粉鹽水球菌的生長。

2.2 沙蟹汁發酵過程中微生物的變化

沙蟹汁發酵過程中菌落總數變化結果如圖1所示。由圖1可知，沙蟹在絞碎后，未進行發酵時存在一定的微生物，其可能來源于空氣或者沙蟹內部存在的微生物，在發酵的過程中適合發酵環境的微生物繼續生存，不適合發酵環境的微生物被淘汰掉。在發酵前3 d時，沙蟹汁中微生物數量急劇增加，達到2.6×107CFU/m L；發酵3 d后，微生物數量減少，其可能的原因是高鹽度使得大多數不適合生存的微生物死亡，沙蟹汁發酵速度緩慢。

圖1 沙蟹汁發酵過程中菌落總數變化Fig.1 Changes of totalnumber of bacterial colony in crab sauce fermentation process

沙蟹汁發酵過程中各種微生物的變化結果如圖2所示。由圖2可知，沙蟹汁發酵過程中（0～15 d）優勢微生物為馬胃葡萄球菌；發酵0～3 d有阿爾萊特葡萄球菌出現；發酵第6天有腐生葡萄球菌出現；發酵6～15 d時蠟樣芽孢桿菌數量大幅增加；發酵第9天時出現解淀粉鹽水球菌。表明從發酵第6天開始出現腐敗現象。

圖2 沙蟹汁發酵過程中微生物組成變化Fig.2 Changes ofm icrobiologicalcompositions in crab sauce fermentation process

2.3 沙蟹汁發酵過程中理化指標變化

2.3.1 沙蟹汁發酵過程中氨基酸態氮含量的變化

沙蟹汁發酵過程中氨基酸態氮含量變化結果如圖3所示。由圖3可知，沙蟹汁發酵過程中氨基酸態氮在前6 d迅速增加，6 d以后增加緩慢，在第15天時，沙蟹汁中氨基酸態氮含量達到0.43 g/100m L，達到三級魚露氨基酸態氮含量標準[19]。氨基酸態氮的變化是蟹肉在微生物及酶的共同作用結果，沙蟹汁中5種微生物有一定的產蛋白酶能力，但產蛋白酶能力較弱，說明其發酵過程中前期氨基酸態氮的變化主要是沙蟹自身內源酶作用的結果。在發酵前期，內源酶活性較高，底物濃度較大，氨基酸態氮含量迅速增加；隨著發酵時間的延長，內源酶酶活性降低，主要依靠微生物蛋白酶酶解，此外到發酵后期，蟹肉被酶解完全，所以氨基酸態氮含量變化緩慢。

圖3 沙蟹汁發酵過程中氨基酸態氮含量變化Fig.3 Changes of am ino acid nitrogen contents in crab sauce fermentation process

2.3.2 沙蟹汁發酵過程中揮發性鹽基氮含量變化

揮發性鹽基氮是產品發酵過程中腐敗微生物作用的產物，標志著水產品新鮮與否的質量指標。沙蟹汁發酵過程中揮發性鹽基氮含量的變化結果見圖4。由圖4可知，沙蟹汁在發酵過程中揮發性鹽基氮含量增加，發酵前期增加緩慢，發酵12～15 d增加迅速。發酵15 d時，沙蟹汁中揮發性鹽基氮含量為105mg/100m L，這與發酵過程中蠟樣芽孢桿菌數量增加有關。ANIHOUVIVB等[20]研究報道，經自然發酵的木薯魚揮發性鹽基氮含量達到（264.7～389.9）mg/100g；GASSEM M A等[21]對沙特阿拉伯腌漬發酵魚微生物及理化性質進行研究表明，其揮發性鹽基氮含量范圍為（32.2～131.82）mg/100 g。較高的揮發性鹽基氮的含量表明氨基酸被破壞的越多，為產品安全性帶來隱患，需要對其控制進行研究。

圖4 沙蟹汁發酵過程中揮發性鹽基氮含量變化Fig.4 Changes of volatile basic nitrogen contents in crab sauce fermentation process

2.3.3 沙蟹汁發酵過程中總氮含量變化

沙蟹汁發酵過程中總氮含量的變化結果如圖5所示。由圖5可知，沙蟹汁發酵過程前9d總氮含量上升至0.76g/100m L，其原因可能是因為在前9 d，內源酶活性較高，分解蟹肉蛋白的能力較強，這與發酵前期沙蟹汁氨基態氮含量增加較快的結論一致，但在9～12 d時，沙蟹汁總氮含量降低，其原因可能是微生物的代謝消耗較多，由2.2可以看出，發酵至第9 d時，解淀粉鹽水球菌出現，代謝較快，消耗總氮，導致其總氮含量下降。發酵第12天時，蠟樣芽孢桿菌數量增加，這也導致2.3.2中揮發性鹽基氮的大幅度增加，由于蠟樣芽孢桿菌產蛋白酶，使得沙蟹汁中總氮和氨基酸態氮增加，并且此時沙蟹汁中活菌數降低，微生物消耗量也減少，最終導致產品中總氮含量上升。

圖5 沙蟹汁發酵過程中總氮含量變化Fig.5 Changes of totalnitrogen contents in crab sauce ferm entation process

2.4 沙蟹汁發酵過程中游離氨基酸含量的變化

沙蟹汁發酵過程中游離氨基酸含量變化結果如表2所示，由表2可知，在發酵前6 d，沙蟹汁中游離氨基酸的含量增加，達到3.06g/100m L，6 d后游離氨基酸的量變化緩慢，后期略有降低，這說明沙蟹蟹肉的酶解主要是在前6d，這與2.3.1氨基酸態氮含量的變化相符。后期降低可能是因為腐敗微生物的作用，發酵環境發生變化，游離氨基酸轉變為揮發性鹽基氮等物質，這與齊利寧等[5]對江洪魚露發酵過程中氨基酸分析結果相似。在所有游離氨基酸中，谷氨酸的含量最高，在沙蟹汁發酵過程中谷氨酸含量略有增加，谷氨酸為鮮味氨基酸，是水產品調味料鮮味的主要來源。其次沙蟹汁發酵過程中含量較高的氨基酸還有天冬氨酸、丙氨酸及精氨酸，劉天天[1]研究表明，沙蟹汁中甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸及精氨酸滋味活性值（tasteactive value，TAV）均＞1，是沙蟹汁鮮味成分的主要貢獻者。沙蟹汁中鮮味氨基酸的增加主要在前6 d，到后期了增加緩慢然后略有降低。

表2 沙蟹汁發酵過程中游離氨基酸的組成與含量Table 2 Composition and content of free am ino acid in crab sauce fermentation process g/100 m L

3 結論

沙蟹汁發酵過程中微生物主要有馬胃葡萄球菌、阿爾萊特葡萄球菌、腐生葡萄球菌、解淀粉鹽水球菌及蠟樣芽孢桿菌，其中馬胃葡萄球菌為優勢菌。發酵過程中菌落總數在第3天達到2.6×107CFU/m L，高鹽度導致后期降低，最終達到7.6×105CFU/m L。氨基酸態氮含量在整個發酵過程中增加，前期增加較快，后期變的緩慢，其含量最終達到0.43 g/100m L，揮發性鹽基氮含量前期增加較慢，后期增加較快，最終含量達到105mg/100m L，總氮和游離氨基酸含量均呈現先增加后降低，最終分別達到0.72 g/100m L、2.99 g/100m L。

沙蟹汁發酵過程中，微生物產蛋白酶能力較弱，發酵前期蟹肉的酶解主要是沙蟹體內內源酶的作用，后期主要是微生物蛋白酶酶解，其理化指標的變化與微生物有一定的聯系。本研究明確了沙蟹汁發酵過程中微生物與理化指標變化之間的聯系，為沙蟹汁的研究及傳統工藝的改進奠定了一定的基礎。