百香果果漿內生細菌的分離鑒定及生長條件的研究

陳正培，吳婉瑩，張 銀，向 煜，余啟明，蔡錦源，熊建文*

（廣西科技大學 鹿山學院 食品與化學工程系，廣西 柳州 545616）

百香果（Passionfora edulis）屬于西番蓮科，又稱雞蛋果、巴西果，其主產于熱帶和亞熱帶地區，于1913年引入我國。目前在臺灣、福建、廣西、云南等地均有種植，且得到了大力發展[1-2]。百香果主要分為紫色百香果和黃色百香果，其中紫色百香果在市面上更為常見[3]。百香果果汁豐富，香味濃郁，含有豐富的揮發性香味成分，PERESTRELOR等[4]研究表明，百香果香味成分達到103種，其中包含了蘋果、香蕉等水果中的主要香味成分，百香果也是因此而得名，并享有“果汁之王”的美譽[5-6]。百香果營養成分豐富，不僅含有7種人體必需氨基酸、多種對人體有益的礦物質元素（Na、K、Ca 、Mg、Zn、Fe、Ge），還含有豐富的蛋白質、膳食纖維、維生素C、維生素E和糖類等營養物質[7-8]。

百香果果汁偏酸，不宜直接食用，因此其果漿常被加工成果汁飲品。為了豐富百香果果汁飲品的種類，滿足人們對生活質量日益提高的要求，對百香果果汁研究從單一的果汁飲料逐漸向復合的果汁飲料轉變。如將百香果分別與芒果、菠蘿、雪梨、黃瓜、火龍果、沙田柚等水果研制成復合果汁飲品[9-17]。此外，石小瓊等[18]研發了糯米百香果果酒；楊玉霞等[19-21]對百香果果酒的發酵進行了探索，均得到了較好的發酵工藝；潘嫣麗等[22]對百香果果醋進行了研發。目前，對百香果果漿的研究主要集中在成分分析、果汁加工工藝、果汁的保藏等方面，然而對百香果果漿中的內生菌研究鮮見報道。陸小平等[23]分別從香蕉、柑橘中分離到的內生細菌對常見的植物病原菌具有一定的拮抗作用，而百香果果汁存在的內生細菌是否有類似的作用，百香果內生細菌對深加工有何影響等問題尚不清楚。因此，對百香果果汁內生菌的分離和鑒定具有一定的研究價值。

本研究以柳州地區紫色百香果鮮果為原料，采用平板計數瓊脂（plate countagar，PCA）培養基從百香果中分離純化得到內生細菌，通過分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并對其生長條件進行研究。通過對百香果果漿內生菌的研究，可以為后續解決百香果果漿加工過程中發生的內源性微生物污染提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮百香果：種植于柳州地區的紫色百香果。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：廣東環凱微生物有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索來寶生物有限公司；瓊脂糖（分析純）：法國BIOWEST公司；2×MasterM ix：美國Thermo公司；Ⅱ型核酸染料：北京派拓科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化試劑（北京）有限公司。

1.1.3 培養基

平板計數瓊脂（液）培養基：胰蛋白胨5 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 L。

LB固體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。LB液體培養基中不加入瓊脂。

牛肉膏蛋白胨液體培養基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl5 g，蒸餾水1 L。

以上培養基均在121℃條件下滅菌20min。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；L9800聚合酶鏈式反應儀（polymerase chain reaction，PCR儀）：萊普特科學儀器（北京）有限公司；Nikon Eclipse E200光學顯微鏡：上海衡浩儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取成熟度一致、表面無任何機械損傷、大小均勻的新鮮的百香果作為實驗材料，在超凈工作臺中，先用無菌水沖洗百香果表面，再將百香果放置在裝有體積分數75%乙醇的燒杯中，浸泡5～10min，取出，無菌水果刀切掉端部，用無菌槍頭輕戳百香果果肉，使之溢出果漿，再吸取鮮濃果漿至無菌離心管中。

1.3.2 內生細菌的分離與純化

在無菌條件下，取2m L新鮮百香果果漿涂布于PCA培養基上，于28℃恒溫培養箱中培養16～24 h，挑選單菌落，采用平板劃線法將其純化兩次，獲得目的菌株。

1.3.3 目標菌株的分子生物學鑒定

將目標菌株接種于LB液體培養基中，于28℃、200 r/min條件下振蕩培養過夜，菌液室溫條件下8000 r/min離心1min，去掉上清液，取沉淀，采用DNA提取試劑盒提取菌株的DNA。以其為模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對其16SrDNA序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×PCRM ix 10.0μL，27F 0.5μL，1492R 0.5μL，模板DNA 1.0μL，雙蒸水（ddH2O）8.0μL。PCR擴增程序：94℃預變性5min；98℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共循環30次；72℃再延伸5min。PCR擴增產物送至華大基因生物公司進行測序。

測序結果在美國國立生物技術信息中心（national center forbiotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用軟件MEGA6.0中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 目標菌株生長條件的研究

培養基的選擇：從平板上挑選目標菌株分別接種到pH值為7.0的9.9m LLB液體培養基、不添加瓊脂的PCA培養基、牛肉膏蛋白胨液體培養基中，28℃、200 r/min恒溫振蕩培養10 h。然后按1%（V/V）的接種量接種至對應培養基中，28℃、200 r/min恒溫振蕩培養12 h，用紫外分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值）。

最適生長pH的測定：用無菌接種環取試管中保存的目標菌株1環，接種到LB培養基中，于37℃培養10 h，測定菌液在波長600nm處的吸光度值，調整菌液的OD600nm值為0.6，將其作為種子液。然后將目標菌株按1%的接種量接種于不同pH值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）的LB液體培養基中，在28 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養12 h，測定OD600nm值。

最適生長溫度的測定：將目標菌株按1%的接種量接種于pH值為5.5的LB液體培養基中，然后分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，200 r/min恒溫振蕩培養12h，測定OD600nm值。

生長曲線的測定：將目標菌株按照1%的接種量接種于pH 5.5的LB液體培養基中，在35℃、200 r/min的條件下恒溫振蕩培養，每隔2 h測定OD600nm值。

1.3.5 數據處理

采用SPPSS 22.0進行數據處理；采用Origin 9.1進行圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離及鑒定

2.1.1 形態觀察

利用PCA培養基對百香果果漿中的內生細菌進行分離、純化，得到形態均一的淺黃色菌落。選取3株特征菌株（編號為GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19）進行菌種鑒定。其在LB培養基上的菌落形態及細胞形態見圖1。由圖1A可知，3株細菌在LB培養基上的單菌落均為圓形，表面潤滑，菌落隆起，菌落呈淺黃色不透明狀。由圖1B可知，3株菌均為短桿型革蘭氏陽性細菌，菌體長1.5～2.0μm、寬0.5～0.8μm，兩端鈍圓。絕大多數單個存在，也有成串排列。

圖1 菌株GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19的菌落形態（A）及細胞形態（B）Fig.1 Colonialmorphology(A)and cellm orphology(B)of strain GJ2-5,GJ2-13 and GJ2-19

2.1.2 分子生物學鑒定

分別以菌株GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19的基因組DNA為模板，以細菌鑒定通用引物27F及1492R進行PCR擴增，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，結果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產物均在1 500 bp左右，與預期結果相符，送去測序。

圖2 16S rDNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gelelectrophoresis of 16S rDNA PCR products

圖3 基于16S rDNA序列3株菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 3 strains based on 16S rDNA sequences

百香果果漿內生細菌GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19的16SrDNA序列經同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA基因序列，構建系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，3株菌均屬于泛菌屬（Pantoea），其中，菌株GJ2-5和GJ2-13均與分散泛菌（Pantoea dispersa）聚于一支，親緣關系最近，因此，鑒定菌株GJ2-5、GJ2-13為分散泛菌（Pantoeadispersa）。菌株GJ2-19與Pantoea eucrina聚于一支，親緣關系最近，因此鑒定菌株GJ2-19為Pantoeaeucrina。

2.2 百香果果漿內生細菌培養條件的研究

2.2.1 培養基的選擇

圖4 百香果果漿內生細菌生長培養基的選擇Fig.4 Selection of grow th medium of endophytic bacteria from passion fruit pulp

由圖4可知，3株內生細菌在3種培養基上的生長情況均呈現LB培養基＞PCA培養基＞牛肉膏蛋白胨培養基的趨勢，且在LB培養基與PCA培養基上的生長情況差異極顯著（P＜0.01）。因此，LB培養基更適合用于3株百香果果漿內生細菌的培養。

2.2.2 最適生長pH值的選擇

圖5 百香果果漿內生細菌最適生長pH值的測定Fig.5 Determ ination of optimalgrow th pH of endophytic bacteria from passion fruit pulp

由圖5可知，該3株內生細菌在pH 4.0～9.0之間生長良好，其最適pH值均為5.5，但在pH 3.0以下其生長均受到強烈的抑制。百香果果漿的pH在2.0～3.0之間，說明從百香果果漿中分離到的泛菌具有較強的耐酸性，百香果鮮果果漿可抑制泛菌屬的生長，但不能殺死該泛菌屬。

2.2.3 最適生長溫度

圖6 百香果果漿內生細菌最適生長溫度的測定Fig.6 Determ ination of optimalgrow th temperature of endophytic bacteria from passion fruit pulp

由圖6可知，3株內生細菌在培養溫度為24～40℃之間均呈現良好的生長狀況，在該范圍內其生長受溫度變化的影響小，屬于中溫型細菌，且最適生長溫度均為35℃。但當溫度低于24℃之前（或高于40℃之后），其生物量隨著溫度的降低（或溫度的升高）呈現顯著下降的趨勢（P＜0.05），即在低溫下和在高溫下對溫度的敏感性明顯增強。

2.2.4 生長曲線

圖7 百香果果漿內生細菌的生長曲線Fig.7 Grow th curves of endophytic bacteria from passion fruit pulp

由圖7可知，這3株內生細菌的生長趨勢一致，均在接種后的6h以內生長緩慢，處于適應期，該時期細菌主要進行細胞分裂必需物質的準備；在6～18h范圍內快速生長，處于對數生長期，主要進行細胞分裂；在18～22h范圍內處于平穩期，主要進行次級代謝產物的合成；22 h以后進入衰亡期。

3 結論

本研究利用PCA培養基從百香果果漿中分離得到3株菌落形態單一、均呈淺黃色的內生細菌，編號為GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19，經革蘭氏染色，均呈革蘭氏陽性。通過分子生物學鑒定，鑒定3株內生細菌均為泛菌屬（Pantoea），其中菌株GJ2-5和GJ2-13均為分散泛菌（Pantoea dispersa），菌株GJ2-19為Pantoeaeucrina。同時，對這3株菌的生長條件進行了研究，結果表明，3株內生細菌的最適生長培養基為LB液體培養基，最適生長pH值為5.5，最適生長溫度為35℃，生長周期為遲滯期（0～6 h）、對數生長期（6～18 h）、平穩期（18～22 h）和衰亡期（22 h以后）。