凝結(jié)芽孢桿菌中耐熱木酮糖激酶基因的克隆表達(dá)及生信分析

聶 恬，孟未群，李夢(mèng)然，張玉明，倪志華*

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

利用秸稈、木材等可再生資源生物煉制生物基產(chǎn)品是生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其技術(shù)關(guān)鍵是葡萄糖和木糖的高效生物轉(zhuǎn)化。與代謝葡萄糖不同，微生物對(duì)木糖利用率普遍不高。細(xì)菌中木糖分解代謝涉及兩種重要的酶：木糖異構(gòu)酶（EC 5.3.1.5）和木酮糖激酶（EC 2.7.1.17）。木糖異構(gòu)酶將木糖代謝為木酮糖，然后由木酮糖激酶將其轉(zhuǎn)化為木酮糖5-磷酸后進(jìn)入磷酸戊糖途徑或磷酸解酮酶途徑以分解代謝[1]。微生物中木酮糖激酶的克隆表達(dá)與理化性質(zhì)的研究已有大量報(bào)道[2-3]。通常，來源于耐/嗜熱微生物的酶具有耐微生物污染、催化能力強(qiáng)和高溫穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)催化領(lǐng)域獨(dú)具優(yōu)勢(shì)[4]。AHMAD S等[5-6]對(duì)兩株耐熱菌Saccharococcus caldoxylosilyticus和海棲熱袍菌（Thermotogamaritima）中的木酮糖激酶進(jìn)行了系統(tǒng)研究，獲得了高活性、耐高溫的催化酶。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）具有高溫發(fā)酵木糖和葡萄糖生產(chǎn)乳酸的能力[7-8]，已經(jīng)成功應(yīng)用于秸稈、淀粉等可再生資源的生物煉制[9-10]，對(duì)其所含功能酶的克隆、表達(dá)和純化研究已經(jīng)多有報(bào)道[11-14]。然而，針對(duì)該菌種的木糖代謝機(jī)制的研究還很匱乏。ZHENG Z等[15]首次從木糖操縱子角度，研究了B.coagulans NL01中的木酮糖激酶，然而未對(duì)該酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和耐熱機(jī)制進(jìn)行研究。

B.coagulans IPE22是本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的一株乳酸生產(chǎn)菌，可高溫發(fā)酵木糖生產(chǎn)L-乳酸[16]，說明該菌株中一定具有高效的木糖代謝酶系。因此，本研究擬對(duì)B.coagulans IPE22中木酮糖激酶基因Bc-XK進(jìn)行克隆表達(dá)和生物信息學(xué)分析，并對(duì)其熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究，最后將木酮糖激酶Bc-XK與其它細(xì)菌來源的木酮糖激酶進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)、活性位點(diǎn)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析，旨在闡述該酶的耐熱機(jī)制，為其工業(yè)化應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）IPE22、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：本實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化鈉1%、瓊脂粉1.5%，121℃高壓滅菌20min。液體LB培養(yǎng)基中不添加瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑

載體pET-30a：美國Novagen公司；His-Trap鎳親和層析柱：美國GE health公司；細(xì)菌基因組（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、限制性內(nèi)切酶NcoI（10 U/μL）和XhoI（10U/μL）、T4DNA連接酶（350U/μL）：寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5430型臺(tái)式高速離心機(jī)：德國艾本德公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇潔凈化設(shè)備有限公司；PowerPac 300電泳儀：美國伯樂公司；2720型PCR基因擴(kuò)增儀：美國ABI公司；MLS-3750型全自動(dòng)滅菌鍋：日本三洋公司；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木酮糖激酶基因Bc-XK的克隆

將B.coagulans IPE22接種于LB液體培養(yǎng)基中，45℃、150 r/m in條件下培養(yǎng)16 h，離心，收集菌體，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取B.coagulans IPE22基因組DNA。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（national center forbiotechnology information，NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫中B.coagulans 36D1（登錄號(hào)：CP003056.1）的木酮糖激酶基因信息設(shè)計(jì)基因Bc-XK的PCR擴(kuò)增引物，正向引物為5'-CATGCCATGGCTATGAAATATGCAATCGGTGTC-3'，反向引物為5'-CCGCTCGAGCGGTTAAATTTCATCTGTTTTCCCT-3'。引物中，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NcoI（正向引物）和XhoI（反向引物）。以基因組DNA為模板，采用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[11]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 重組菌的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，采用限制性核酸內(nèi)切酶NcoI和XhoI分別對(duì)純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-30a進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化目的片段。采用T4DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物，以獲得重組質(zhì)粒pET-30a-Bc-XK。采用氯化鈣法[17]將重組質(zhì)粒pET-30a-Bc-XK轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）宿主菌中，涂布于含有25mg/L卡那霉素的LB平板上，于37℃條件下倒置培養(yǎng)18 h。挑取陽性克隆子送至蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 Bc-XK基因的表達(dá)

將重組菌E.coli BL21 pET-30a-Bc-XK接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm值約0.6后，添加終濃度為0.5mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，8 000 r/min離心10min，收獲菌體。

1.3.4 重組酶Bc-XK的純化

獲得的菌體在冰水浴中進(jìn)行超聲破壁，超聲條件為功率95W，12m in，2 s工作，2 s間隔，360個(gè)循環(huán)。細(xì)胞破碎液在4℃、10 000 r/min條件下離心15min，棄沉淀，取上清液，使用鎳柱進(jìn)行蛋白純化[4]。采用10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)重組酶Bc-XK的分子質(zhì)量。

1.3.5 木酮糖激酶活性檢測(cè)及熱穩(wěn)定性研究

參照文獻(xiàn)[15]測(cè)定木酮糖激酶活性。將酶促反應(yīng)體系分別置于50℃、60℃和70℃，每隔60min測(cè)定一次木酮糖激酶活性，以相對(duì)酶活力表示。相對(duì)酶活力定義為殘留酶活力與未經(jīng)熱處理的初始酶活力之比值。

1.3.6 分析方法

參照《生物信息學(xué)》[18]進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和NetPhosBac（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosBac/）對(duì)Bc-XK基因及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析；采用Prositeexpasy（https：//prosite.expasy.org/）預(yù)測(cè)Bc-XK基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用NCBI-CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/w rpsb.cgi）分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)；采用SW ISS-MODEL（https：//sw issmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測(cè)高級(jí)結(jié)構(gòu)。

從NCBI中選取15株細(xì)菌的木酮糖激酶氨基酸序列，使用MEGA X 10.0.5軟件將其與Bc-XK氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。基于木酮糖激酶氨基酸序列，采用最大似然（maximum likelihood，ML）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Timetree數(shù)據(jù)庫（http：//www.timetree.org/）對(duì)木酮糖激酶來源物種系統(tǒng)進(jìn)化地位進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木酮糖激酶基因Bc-XK的克隆

以B.coagulans IPE22基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度約為1 500 bp，與Bc-XK基因的預(yù)期片段大小相符合。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of PCR amplification product

2.2 重組酶Bc-XK的表達(dá)與純化

重組菌E.coli BL21 pET-30a-Bc-XK經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、表達(dá)后，對(duì)重組酶Bc-XK進(jìn)行純化和SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，重組菌E.coli BL21 pET-30a-Bc-XK經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組酶Bc-XK，其分子質(zhì)量為56 kDa，該結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。經(jīng)鎳柱純化后，重組酶Bc-XK條帶單一，達(dá)到電泳純，比酶活力為（20.56±3.31）U/mg。

圖2 粗酶液和重組蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE results of crude enzyme and recombinant protein

2.3 重組酶Bc-XK的熱穩(wěn)定性研究

B.coagulans IPE22可高溫發(fā)酵木糖生產(chǎn)乳酸，對(duì)源于其的重組酶Bc-XK進(jìn)行溫度穩(wěn)定性研究結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，Bc-XK在50℃穩(wěn)定性非常好；當(dāng)溫度為60℃時(shí)，重組酶Bc-XK也表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，在180min內(nèi)幾乎沒有活性損失；當(dāng)溫度為70℃時(shí)，孵育180min后，重組酶Bc-XK的相對(duì)酶活力為（39±3.1）%。說明重組酶Bc-XK具有良好的熱穩(wěn)定性，在工業(yè)上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[19-20]。并且，可以利用基因工程方法將Bc-XK基因轉(zhuǎn)入其他具備生物煉制能力的細(xì)菌或酵母中，實(shí)現(xiàn)微生物對(duì)木質(zhì)纖維素中葡萄糖或木糖的全利用[21]。

圖3 重組酶Bc-XK的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermalstability of recombinase Bc-XK

2.4 重組酶Bc-XK的生物信息學(xué)分析

2.4.1 重組酶Bc-XK的結(jié)構(gòu)分析

將Bc-XK基因的核苷酸序列信息提交至NCBI的Gen-Bank數(shù)據(jù)中，登錄號(hào)為MF543361。利用ProtParam對(duì)Bc-XK基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，Bc-XK基因含有堿基長(zhǎng)度為1 536 bp的一個(gè)開放閱讀框，共編碼511個(gè)氨基酸（登錄號(hào)：ATB56311.1），該基因編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為5.46。

經(jīng)Prosite-expasy和NetPhosBac預(yù)測(cè)，重組酶Bc-XK為親水蛋白質(zhì)，含有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和多個(gè)磷酸化位點(diǎn)?；赑rosite-expasy的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，重組酶Bc-XK中α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈含量豐富，分別為38.16%、43.25%和18.59%。

利用NCBI-CDD分析重組酶Bc-XK的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖4A所示。由圖4A可知，重組酶Bc-XK含有多個(gè)木酮糖結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合位點(diǎn)和鎂三磷酸腺苷（magnesium adenosine triphophate，MgATP）結(jié)合位點(diǎn)，這與FLANAGAN T等[22]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，重組酶Bc-XK中含有墨角藻糖激酶-葡萄糖酸激酶-甘油激酶-木酮糖激酶（fucolokinase-gluconokinase-glycerolkinase-xylulokinase，F(xiàn)GGY）結(jié)構(gòu)域和氮端核苷酸結(jié)合域-糖激酶-熱休克蛋白-肌動(dòng)蛋白（N-terminalnucleotidebinding domain-sugarkinase-heatshock protein-actin superfam ily，NBD-sugar-kinase-HSP70-actin su-perfamily）超家族結(jié)構(gòu)域。重組酶Bc-XK中具有的FGGY結(jié)構(gòu)域是激酶典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，與E.coli中木酮糖激酶類似[23]。NBD-sugar-kinase-HSP70-actin結(jié)構(gòu)域中熱休克蛋白（heatshock protein，HSP）具有輔助熱變性蛋白質(zhì)恢復(fù)高級(jí)結(jié)構(gòu)的功能，因此，推測(cè)重組酶Bc-XK中的HSP結(jié)構(gòu)域可能與其高溫催化特性有關(guān)。

使用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)重組酶Bc-XK的高級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4B。由圖4B清晰可見酶的催化位點(diǎn)：天冬氨酸-8、蘇氨酸-11和天冬氨酸-239。并且，圖4B中也顯示了Bc-XK中底物（木酮糖）結(jié)合區(qū)域與催化位點(diǎn)相鄰，這與NCBI-CDD預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖4 重組酶Bc-XK的保守結(jié)構(gòu)域（A）和高級(jí)結(jié)構(gòu)（B）預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Forecasted results of conserved domains(A)and advanced structure(B)of recombinase Bc-XK

2.4.2 重組酶Bc-XK的活性位點(diǎn)分析

為了研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，使用ClustalX2軟件將重組酶Bc-XK與海棲熱袍菌（Thermotogamaritima）中的木酮糖激酶Tm-XK、模式生物大腸桿菌（E.coli）中的木酮糖激酶Ec-XK和常見工業(yè)乳酸生產(chǎn)菌短乳桿菌（Lactobacillusbrevis）中的木糖激酶Lb-XK的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，木酮糖激酶Bc-XK與Tm-XK、Ec-XK和Lb-XK的氨基酸序列相似性分別為38%、38%和57%，且4個(gè)木酮糖激酶均含有27個(gè)活性位點(diǎn)，包括3個(gè)催化位點(diǎn)（見圖4）：天冬氨酸-8、蘇氨酸-11、天冬氨酸-239；2個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)：天冬氨酸-8、天冬氨酸-239；7個(gè)木酮糖底物結(jié)合位點(diǎn)：谷氨酰胺-80、甲硫氨酸-81、組氨酸-82、色氨酸-100、天冬氨酸-239、天冬酰胺-240、甲硫氨酸-294；21個(gè)MgATP結(jié)合位點(diǎn)：天冬氨酸-8、甘氨酸-10、蘇氨酸-11、絲氨酸-12、絲氨酸-13、賴氨酸-15、天冬氨酸-239、異亮氨酸-259、甘氨酸-260、蘇氨酸-261、甘氨酸-301、酪氨酸-302、亮氨酸-304、絲氨酸-305、苯丙氨酸-317、丙氨酸-318、亮氨酸-320、甘氨酸-402、甘氨酸-403、甘氨酸-404、絲氨酸-407。

圖5 重組酶Bc-XK與其他木酮糖激酶氨基酸序列比對(duì)與活性位點(diǎn)分析Fig.5 Am ino acid sequence alignm ent and active sites analysis between recombinase Bc-XK and other xylulose kinase

值得指出的是，木酮糖激酶Bc-XK與Tm-XK雖然都是耐熱木酮糖激酶，但是其氨基酸序列相似性不高。木酮糖激酶Bc-XK和Tm-XK的27個(gè)活性位點(diǎn)中存在7個(gè)差異位點(diǎn)（絲氨酸-12、異亮氨酸-259、甘氨酸-301、絲氨酸-305、苯丙氨酸-317、丙氨酸-318和亮氨酸-320），且僅涉及MgATP結(jié)合位點(diǎn)功能區(qū)域，而其他活性位點(diǎn)（木酮糖結(jié)合位點(diǎn)、催化位點(diǎn)和金屬結(jié)合位點(diǎn)）均相同。一般而言，決定酶促反應(yīng)機(jī)制的關(guān)鍵位點(diǎn)是催化位點(diǎn)[22]。木酮糖激酶Bc-XK與Tm-XK的催化位點(diǎn)完全相同，均為天冬氨酸-8、蘇氨酸-11和天冬氨酸-239。因此，木酮糖激酶Bc-XK和Tm-XK具有類似的催化機(jī)制。推測(cè)木酮糖激酶Bc-XK和Tm-XK在MgATP結(jié)合位點(diǎn)存在的差異僅會(huì)導(dǎo)致底物結(jié)合能力變化，影響酶的催化反應(yīng)速度高低。

2.4.3 木酮糖激酶Bc-XK的遺傳學(xué)分析

重組酶Bc-XK的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6A。由圖6A可知，16個(gè)木酮糖激酶聚為4個(gè)類群（I、II、III和IV）。其中，類群I由來自芽孢桿菌屬（Bacillus）的木酮糖激酶組成；類群II和III由來自乳酸細(xì)菌的木酮糖激酶組成；類群IV由來自T.maritim e、T.neapolitana和E.coli中的木酮糖激酶組成。為了驗(yàn)證基于木酮糖激酶氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹是否與物種的進(jìn)化地位一致，基于Timetree數(shù)據(jù)庫，對(duì)本研究涉及的14個(gè)物種進(jìn)行分析[24]，結(jié)果如圖6B所示。由圖6B可知，涉及的14個(gè)物種聚類為4個(gè)類群：類群I為包括凝結(jié)芽孢桿菌在內(nèi)的5株芽孢桿菌屬細(xì)菌；類群II均為乳酸細(xì)菌；類群III為E.coli；類群IV為兩種嗜熱細(xì)菌（T.maritime和T.neapolitana）。與圖6A結(jié)果類似，說明基于木酮糖激酶構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以很好的反映出物種的進(jìn)化關(guān)系。從系統(tǒng)進(jìn)化和發(fā)育角度而言，雖然Bc-XK不是一個(gè)嶄新的催化酶，但是其具有良好的高溫催化能力和優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，在工業(yè)上亦具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。

圖6 基于木酮糖激酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（A）和基于物種的時(shí)間樹（B）Fig.6 Phylogenetic tree based on am ino acid sequence ofxylulose kinase(A)and time tree based on species(B)

2.5 基于生物信息學(xué)分析木酮糖激酶Bc-XK熱穩(wěn)定性機(jī)理

有研究報(bào)道，耐熱蛋白質(zhì)富含帶電氨基酸殘基；高級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)較多且肽鏈長(zhǎng)；與α-螺旋形成有關(guān)的丙氨酸含量高；富含金屬離子結(jié)合位點(diǎn)等[25-26]。通過生物信息學(xué)分析可知，木酮糖激酶Bc-XK中帶電氨基酸（精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）共有112個(gè)，占總氨基酸數(shù)量21.92%；分子中易于形成α-螺旋的丙氨酸含量位于所有氨基酸組成的第3位，比例為7.80%；高級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量較高，且含有2個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)。因此，木酮糖激酶Bc-XK具有較好的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

菌株B.coagulans IPE22中的木酮糖激酶基因Bc-XK與載體pET-30a連接后，成功在E.coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)。重組酶Bc-XK經(jīng)純化后，比酶活力為（20.56±3.31）U/mg。該酶熱穩(wěn)定性好，可以在60℃保持活力180min以上。生物信息分析結(jié)果顯示，基因Bc-XK含有一個(gè)1 536bp的開放閱讀框，共編碼511個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)為親水蛋白，分子質(zhì)量為56 kDa，等電點(diǎn)為5.46，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈含量豐富，3個(gè)催化位點(diǎn)為天冬氨酸-8、蘇氨酸-11、天冬氨酸-239。氨基酸序列比對(duì)和聚類分析結(jié)果顯示，不同細(xì)菌來源的木酮糖激酶具有高度保守的3個(gè)催化位點(diǎn)，且基于木酮糖激酶構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以很好的反映出物種的進(jìn)化關(guān)系。