異煙酸-巴比妥酸光譜法測定白酒中氰化物方法探討

程銀棋，鄭 欣，周陶鴻，胡家勇，彭青枝，柳 迪

（1.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2.湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430075；3.武漢市華測檢測技術有限公司，湖北 武漢 430223）

氰化物是對含有氰離子或氰基的一類化合物的統稱[1-2]。氰化物可分為無機氰化物（氫氰酸、氰化鉀、氯化氰等）、有機氰化物（乙腈、丙烯腈、正丁腈等）、絡合氰化物（鋅氰絡合物、鐵氰絡合物、鎳氰絡合物、銅氰絡合物等），均能在體內很快析出離子，并迅速與人體類高鐵細胞色素氧化酶結合，生成氰化高鐵細胞色素氧化酶而失去傳遞氧的作用，引起組織缺氧窒息屬于高毒類[3-7]。且與砷化物、汞、鎘、鉻、鉛并稱為國際上公認的六大毒物[8-10]。氰化物是酒類的一項重要安全檢測指標，據許多研究報道白酒中的氰化物主要是由于釀酒原料（如木薯、野生植物根莖等存在植物氰苷；高粱中存在蜀黍氰苷等）、生產工藝（原料表皮處理不干凈）等原因造成[11-15]，對人身體健康危害極大，引起急性中毒，因此，檢測白酒中氰化物含量的準確性顯得尤為重要。

目前，我國規定使用GB 5009.36—2016《食品安全國家標準食品中氰化物的測定》檢測白酒中氰化物，其原理是蒸餾酒在堿性條件下加熱除去高沸點有機物，然后在pH 7.0條件下，用氯胺T將氰化物轉變為氯化氰，再與異煙酸-吡唑啉酮作用生成藍色燃料，與標準系列比較定量。但是其一法異煙酸-吡唑啉酮分光光度法檢測白酒中氰化物含量具有操作繁瑣、耗時長（顯色時間為40m in）、化學試劑不穩定而需臨配制等不利因素[16]，且根據一些報道白酒中存在一些氰絡合物對其實驗干擾，造成假陽性樣品的存在[17-18]；其二法氣相色譜法儀器設備昂貴，縣級食品監測站或中小企業難以承擔儀器設備購置費用[19-20]。

異煙酸-巴比妥酸光譜法具有試劑穩定性好、經濟實惠、操作簡單、耗時短（僅需顯色15m in）等優點[21]，因此，該研究不經過高溫前處理而避免氰絡合物高溫下堿解，結合HJ484—2009《中華人民共和國國家環境保護標準水質氰化物的測定容量法和分光光度法》[22]以及GB 8538—2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》中分光光譜法[23]，探討異煙酸-巴比妥酸光譜法對白酒中氰化物的可行性，并與白酒的國標方法異煙酸-吡唑啉酮光譜法進行方法學上的比較，旨在為小型檢測機構及小中企業提供一種快速、高效且便于操作的白酒中氰化物的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒：選取本院2018年度湖北省內監督抽檢的酒精度為52%vol的樣品；

氰化物標準溶液（標準物質編號GBW（E）080115，質量濃度50mg/L）：中國計量科學研究院；氫氧化鈉、異煙酸、吡唑啉酮、氯胺T、無水乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、乙酸、巴比妥酸、酚酞等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；實驗室用水均為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的二級水。

1.2 儀器與設備

UH5300紫外分光光度計：日立公司；WNB29恒溫水浴鍋：德國Memmert（美墨爾特）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 異煙酸-巴比妥酸光譜法測定白酒中氰化物標準曲

線繪制與樣品檢測

標準曲線繪制：取10支具塞比色管，分別加入1mg/L氰化物標準使用液0、0.20m L、0.40m L、0.80m L、1.20m L、1.60m L、2.00m L、3.00m L、4.00m L和5.00m L，再加入2 g/L氫氧化鈉溶液至10m L，其氰化物含量依次為0、0.20μg、0.40 μg、0.80 μg、1.20 μg、1.60 μg、2.00 μg、3.00 μg、4.00 μg和5.00μg。后加入5.0mL 136 g/L磷酸二氫鉀緩沖溶液，混勻，迅速加入0.30m L 10 g/L氯胺T溶液，立即蓋塞，混勻，放置1～2min。最后加入6.0m L異煙酸-巴比妥酸顯色劑，加水至25m L，混勻。于25℃顯色15m in，后以水為參比，于波長600nm處用1 cm比色皿測定吸光度值，繪制標準曲線，在曲線上查出試樣管中氰化物的質量。

樣品檢測：量取1m L白酒樣品于25m L具塞比色管中，加2 g/L氫氧化鈉溶液至10mL。后續操作方法同上，且整個實驗過程標準管與試樣管應同一批次同時處理。

1.3.2 異煙酸-吡唑啉酮光譜法測定白酒中氰化物標準曲

線繪制與樣品檢測

標準曲線繪制：分別量取1mg/L氰化物標準使用液0、0.8m L、1.6m L、3.2m L、4.0m L、6.0m L、8.0m L于25m L具塞比色管中，補加2 g/L氫氧化鈉至10m L。后處理方法按照GB 5009.36—2016《食品安全國家標準食品中氰化物的測定》第一法分光光度法。以水為參比，于波長638nm處測定吸光度值，且整個實驗過程標準管與試樣管應同一批次同時處理。

1.3.3 精密度試驗

依據1.3.1與1.3.2標準曲線檢測方法，以1.00μg、4.00μg兩個含量點為監測目標，每個含量點量取6組平行樣，比較不同含量下數據的精密度。

1.3.4 準確度試驗

依據1.3.1與1.3.2樣品檢測方法，對氰化物質控樣（未經100%酒精度折算的默認濃度為4.0mg/L）進行6次重復檢測，計算每次重復檢測的分析物濃度。比較不同方法下數據的準確度。

1.3.5 加標回收試驗

選取1個已知含量的樣品，分別添加3個高、中、低濃度水平的氰化物標準溶液于樣品中，然后用1.3.1與1.3.2兩種方法測定，計算加標回收率。

1.3.6 計算公式

白酒中氰化物（以CN-計）含量按式（1）計算

式中：ρ（CN-）為白酒中氰化物的質量濃度，mg/L；m為從校準曲線上查得試樣管中氰化物的質量，μg；V為白酒取樣體積，mL。

1.3.7 數據處理

所有的不同處理均重復3次，數據結果采用統計軟件SPSS 12.0軟件和Origin 8.5軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 異煙酸-巴比妥酸光譜法測定白酒中氰化物標準曲線及檢出限

依據1.3.1作關于氰化物含量（μg，以CN-計）（Y）對吸光度（X）的標準曲線得到：異煙酸-巴比妥酸光譜法線性方程為Y=5.076 4X-0.013 6，相關系數R2=0.999 7；由此說明異煙酸-巴比妥酸測定氰化物含量在0～5.000μg范圍內呈良好的線性。對于空白樣品進行20次重復試驗得到的吸光度的均值加上3倍標準偏差計算檢出限，以分析物的濃度單位進行表征，結果見表1。

表1 檢出限計算結果Table 1 Results of detection lim it

由表1可知，異煙酸-巴比妥酸光譜法測定白酒中氰化物的方法檢出限為0.015mg/L。根據GB 2757—2012《食品安全國家標準蒸餾酒及其配制酒》中要求氰化物（以HCN計，100%酒精度折算）含量低于8mg/L，綜上所述：異煙酸-巴比妥酸光譜法測定白酒中氰化物含量方法可行。

2.2 兩種光譜法測定氰化物的精密度結果比較

根據1.3.2作標準曲線方法，作關于氰化物含量（μg，以CN-計）（Y）對吸光度值（X）的標準曲線，得到異煙酸-吡唑啉酮光譜法線性方程為Y=8.483 5X-0.003 8，相關系數R2=0.999 7。

以1.00μg、4.00μg兩個含量點為監測目標，每個含量點量取6組平行樣，比較不同含量下測定的吸光度值，根據上述線性方程計算得到氰化物含量如表2所示。由表2可知，異煙酸-吡唑啉酮法和異煙酸-巴比妥酸法測定白酒中氰化物的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別在0.370%～2.607%、0.509%～2.151%范圍內，均符合GB 5009.36—2016《食品安全國家標準食品中氰化物的測定》第一法分光光度法相對標準偏差（＜10%）要求，表示該方法精密度良好。

表2 兩種光譜法測定氰化物的精密度結果比較Table 2 Comparison of precision results of two kinds of spectrometry methods for determ ination of cyanide

2.3 兩種光譜法測定白酒中氰化物的準確度結果比較

據報道市場上有些白酒由于原料本身含有氰絡合物，異煙酸-吡唑啉酮法在堿性條件下對白酒進行高溫加熱處理，可能使部分原料本身的氰絡合物堿解成氰離子，造成試驗假陽性的存在，因此，本試驗探討了異煙酸-巴比妥酸法對白酒未進行堿性條件下高溫處理的方法準確性。

表3 兩種光譜法測定氰化物的準確度結果比較Table 3 Comparison of the accuracy results of two kinds of spectrometrymethods for determ ination of cyanide mg/L

本研究選用實驗室的白酒氰化物質控樣（未經100%酒精度折算的默認濃度為4.0mg/L）作為樣品，用兩種光譜法分別進行白酒氰化物含量檢測，且進行6次重復檢測，計算每次重復檢測的分析物濃度，數據結果見表3所示。由表3可知，兩種方法處理后的氰化物質控樣氰化物含量均趨于穩定，數據間無顯著性差異（P＞0.05），因此表明兩種光譜法測定白酒中氰化物含量的準確性較好。

2.4 兩種光譜法測定白酒中氰化物的加標回收結果比較

選取1個氰化物含量為1.049mg/L的白酒樣品，分別添加3個高中低質量濃度水平的氰化物標準溶液（3.000mg/L、1.500mg/L、0.500mg/L）于樣品中，測定氰化物加標回收率，結果見表4。

表4 兩種光譜法測定氰化物的加標回收結果比較Table 4 Com parison of standard recovery results of two kinds of spectrometrym ethods for determ ination of cyanide

由表4可知，異煙酸-吡唑啉酮、異煙酸-巴比妥酸法測定白酒中氰化物加標回收率分別為82.7%～98.8%、81.9%～111.3%，均滿足實驗室要求。此外，由于異煙酸-吡唑啉酮顯色劑不穩定，試驗過程中要現配現用，因此異煙酸-吡唑啉酮法試驗繁瑣耗時，而異煙酸-巴比妥酸法中所用異煙酸-巴比妥酸顯色劑放置于冰箱冷藏，可重復使用數十次，有效期長達1個月以上，且GB 8538—2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》中異煙酸-巴比妥酸光譜法也提到此試劑因堿性強而可于冰箱保存1個月。由于兩種方法加標回收率無明顯差異，說明異煙酸-巴比妥酸光譜法具有較強的試劑穩定性，有利于提高試驗效率，更好滿足實驗室高效快捷的要求。

3 結論

本研究通過研究異煙酸-巴比妥酸光譜法測定白酒中氰化物含量，發現該法在0～5.000μg具有良好的線性相關性，其方法檢出限為0.015mg/L，且與異煙酸-吡唑啉酮光譜法進行準確度、精密度比較均無顯著性差異（P＞0.05）。另外異煙酸-巴比妥酸測定白酒中氰化物具有較好的回收率，更好的試劑穩定性，能滿足實驗室需要，建議國標方法可以增加這一方法，便于提高各檢測機構的氰化物檢測效率。