新型熒光探針制備及茶葉中汞離子檢測的研究

董 哲，李 陽，鄭慶福，王 斌

（1.內蒙古民族大學 分析測試中心，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古通遼市醫院，內蒙古 通遼 028000）

茶作為世界上最受歡迎的風味和健康飲品，含有豐富的營養物質和多種功能性成分，具有抗氧化、抗過敏和抗病毒的作用，還能抑制各種慢性疾病[1-3]。近年來有色金屬礦產開發、燃煤煙氣和固體廢棄物焚燒等途徑產生重金屬有毒物質增多，導致茶葉中劇毒的汞含量超標風險增加。重金屬汞容易通過食物鏈不斷富集到人體中，破壞正常新陳代謝功能[4-6]。因此，準確、高效地檢測茶葉中痕量Hg2+的含量，避免汞超標變得尤為重要。傳統的痕量Hg2+檢測方法包括原子熒光光譜法（atomic fluorescencespectrometry，AFS）、原子吸收光譜法（atom ic absorption spectroscopy，AAS）、電感耦合等離子體-原子發射光譜法（inductivelycoupledplasmaatomic emission spectrometry，ICP-AES）等，但此類方法樣品所需的檢測設備價格高昂、操作過程復雜，單樣品成本高，一定程度上限制了其在更廣泛領域的應用[7-11]。近年來，相較于有毒小分子熒光染料和量子點，金納米團簇（gold nanoclusters，AuNCs）因其尺寸較小、生物相容性良好和斯托克斯位移較大，逐漸成為材料科學及生命科學中的前沿熱點，特別是在生物樣品分析和重金屬檢測中展示出了十分廣闊的應用前景[12-13]。通常所合成的納米團簇化合物穩定性不好，甚至會在短時間內分解，大大限制了其在熒光探針上的實際應用。本研究以S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）作為保護劑和還原劑合成了水溶性好的金納米團簇（GSNO@AuNCs），并以此為熒光探針，建立了潛在高靈敏檢測實際茶葉樣品中Hg2+含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

S-亞硝基谷胱甘肽（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氯金酸（HAuCl3）（分析純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；氫氧化鈉（NaOH）（分析純）、硼氫化鈉（NaBH4）（分析純）：長春鼎國生物技術有限責任公司；氯化鈉（NaCl）、氯化銅（CuCl2）、氯化鉛（PbCl2）、氯化鎂（MgCl2）、氯化鎳（NiCl2）、氯化鈣（CaCl2）、氯化鋅（ZnCl2）、氯化錳（MnCl2）、氯化鎘（CdCl2）、氯化鋇（BaCl2）、氯化鋁（AlCl3）、氯化鉻（CrCl3）、氯化鐵（FeCl3）等化學試劑（均為分析純）：天津市化學試劑三廠。透析袋（截留分子質量8000～10000Da）：上海易佰聚經貿有限公司；茶葉樣品：當地超市。

1.2 儀器與設備

JEM-2100F場發射透射電子顯微鏡：日本電子株式會社；970CRT熒光分光光度計：上海精科儀器儀表有限公司；8453UV-VIS紫外可見分光光度計：美國安捷倫科技公司；ZetasizerNano ZS90納米粒徑電位分析儀：英國馬爾文儀器有限公司；RH-Basic加熱磁力攪拌器：德國艾卡儀器設備有限公司；MARS6微波消解儀：美國培安科技公司；M illi-Q超純水系統：密理博中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 S-亞硝基谷胱甘肽包被的金納米團簇的合成

根據GUO C等[14-16]的研究，將215 μL 10 mmol/L的HAuC14溶液中逐滴加入2.5m L 2mmol/L的GSNO溶液中，加入105μL 1mmol/L的NaOH溶液，并劇烈攪拌30min后，再逐滴加入25μL 12mmol/L的硼氫化鈉溶液，混合物在室溫環境下繼續攪拌5h。將所得淡褐色水溶液，轉移至截留分子質量為8 000～10 000Da透析袋中，于2 000m L超純水中透析24 h，每4 h更換透析容器中的蒸餾水以便去除小分子雜質。所制備的S-亞硝基谷胱甘肽包被的金納米團簇（GSNO@AuNCs）用錫箔紙包好置于4℃冰箱中備用。

1.3.2 不同檢測條件對GSNO@AuNCs熒光性能的影響

樣品的熒光強度值（F）的測定時，其熒光光譜儀激發波長為370nm，掃描范圍550～800nm，狹縫寬度均設為5nm，每個濃度平行測定3次。為了考察不同pH值對檢測時熒光性能的影響，分別取定量的GSNO@AuNCs溶液，并分別調節體系pH值至（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0），混勻后靜置10m in轉移到石英比色皿中測試樣品的熒光強度。為了考察體系鹽濃度對檢測時熒光性能的影響，分別取定量的GSNO@AuNCs溶液，并分別調節體系的NaCl濃度至（0、0.01mmol/L、0.1mmol/L、1.0mmol/L、10mmol/L、100mmol/L和200mmol/L），均混勻后靜置10m in轉移到石英比色皿中測試樣品的熒光強度。為了考察不同混勻時間對檢測時熒光性能的影響，分別取定量的GSNO@AuNCs溶液，混搖后靜置至（0、5min、10min、15min、20min、25min和30m in）后，轉移到石英比色皿中測試樣品的熒光強度。為了考察不同溫度對檢測時熒光性能的影響，在不同反應溫度條件下（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃），分別取定量的GSNO@AuNCs溶液，均混搖后靜置10m in轉移到石英比色皿中測試樣品的熒光強度。

1.3.3 GSNO@AuNCs對Hg2+熒光檢測的標準曲線建立

在室溫（25℃）條件下測量樣品的熒光強度值（F）時，熒光光譜儀激發波長為370 nm，掃描范圍550～800 nm，狹縫寬度均設為5 nm，每個濃度平行測定3次。取100μL的GSNO@AuNCs溶液，向其中加入200μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.0），分別加入一系列100μL不同濃度Hg2+溶液，再向其加入適量的蒸餾水定容至1m L后混搖均勻，靜置10min，轉移到石英比色皿中掃描樣品。最低檢測限（limitof detection，LOD）是通過計算平行測定6次的空白樣品標準差的3倍得到的（3σ）[17]。

1.3.4 精密度及加標回收率實驗

按上述步驟，測試每份樣品的熒光強度后，復測5次，取其6次實驗的平均值（average）計算其標準偏差（standard deviation，SD）和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），以此結果來判定該方法的精密度。樣品加標回收是指取相同兩組試樣，其中一組加入確定含量的待測成分的標準物質，兩組同一時間按相同的實驗步驟測定熒光強度。加入標準物質的一組所對應值減去未加入標準物質一組所對應值的做差值后，與加入標準物質的含量的比值，為樣品加標回收率，其計算公式如下：

1.3.5 干擾金屬離子對GSNO@AuNCs檢測Hg2+影響

在室溫（25℃）條件下，取兩組100μL所配制的1mol/L各 離 子（Na+、Cu2+、Pb2+、Mg2+、Ni2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cd2+、Ba2+、Al3+、Cr3+、Fe3+）溶液，均加入100 μL的GSNO@AuNCs溶液，均向其中加入200μLPBS緩沖溶液（pH 7.0），其中一組加入100μL的0.1mol/L的Hg2+溶液，兩組再加入適量的蒸餾水，分別定容至1m L后混勻，靜置10min，轉移到石英比色皿中測定這兩組樣品的熒光強度。

1.3.6 GSNO@AuNCs對實際茶葉樣品中的Hg2+檢測

稱取0.200 0 g干燥過的茶葉樣品于聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）高壓消解罐中，加入5.0m L濃硝酸及1.5m L過氧化氫，放入微波消解儀內進行消解，結束后轉移至石墨爐電熱趕酸儀于120℃條件下趕酸。30min后將樣品離心（10 000 r/m in），并通過0.22μm微孔濾膜過濾以消除可能的干擾因素，用適量蒸餾水定容至100m L[18-19]。取100μL上述所配制的茶葉消解溶液，加入100μL的GSNO@AuNCs溶液，向其中加入200μLPBS緩沖溶液（pH 7.0），再向其中加入適量的蒸餾水定容至1m L后混勻，靜置10min，轉移到石英比色皿中掃描樣品。

2 結果與分析

2.1 GSNO@Au NCs的表征

采用高倍透射電子顯微鏡和動態光散射儀表征GSNO@AuNCs，結果見圖1。

圖1 GSNO@AuNCs的透射電鏡圖（A）納米粒子尺寸分布（B）Fig.1 Transm ission electron m icroscopy(A)and the nano particle size distributions(B)of GSNO@AuNCs

由圖1A可知，所合成的GSNO@AuNC平均粒徑在2.5nm左右，顆粒呈球形并且分散性較好；由圖1B可知，GSNO@AuNCs的粒徑呈正態分布，其中粒徑為1.5 nm的顆粒最多。

采用紫外-可見吸收光譜和熒光光譜表征GSNO@Au NCs，結果見圖2。

圖2 GSNO@AuNCs的紫外吸收光譜圖（a）、激發光譜（b）和發射光譜（c）Fig.2 Ultraviolet-visible spectrophotometer(a),excitation spectrum(b)and em ission spectrum(c)of GSNO@AuNCs

由圖2可知，a曲線表明了紫外可見吸收光譜峰的位置在波長約360 nm處，可歸屬為樣品所獨有的量子限域效應；而在波長400～600 nm處無特征吸收峰，則表明樣品沒有形成較大的納米顆粒而形成了納米團簇。隨后測量了GSNO@AuNCs的最大激發光譜（b）和最大發射光譜（c），其最大激發波長為370 nm，最大發射波長為635 nm。

2.2 實驗條件優化

按1.3.2方法考察了pH值、鹽離子濃度、反應時間和溫度對GSNO@Au NCs體系熒光猝滅的影響，結果見圖3。

圖3 pH值（A）、鹽離子濃度（B）、反應時間（C）和溫度（D）對GSNO@AuNCs的熒光強度影響Fig.3 Effect of pH(A),NaCl concentration(B),reaction time(C)and temperature(D)on fluorescence intensity of GSNO@AuNCs

由圖3A可知，在pH值在3.0～11.0范圍內對GSNO@Au NCs熒光強度影響微不足道。考慮到檢測對象Hg2+在堿性環境下可能會形成絮狀沉淀，已經實際檢測時的便利性，確定pH值為7.0。由圖3B可知，當體系中的鹽離子（NaCl）濃度在0～200mmol/L時，不會對體系熒光強度造成明顯影響。因此為了實際檢測的簡便性，確定在檢測過程中不額外添加鹽離子；由圖3C可知，GSNO@Au NCs的熒光強度隨著反應時間的增加而增加，10min后已趨于平衡，因此確定反應時間為10min；由圖3D可知，隨著溫度在5～45℃范圍內升高，金納米團簇的熒光強度逐漸降低，可能是介質水的黏度降低，提高了熒光分子與水分子發生碰撞熒光淬滅的幾率，考慮到為更貼近實際樣品的檢測，確定檢測溫度為室溫25℃。結果表明，本方法所制備的熒光探針穩定性較好，對Hg2+的檢測抗干擾能力較強。

2.3 Hg2+的熒光檢測法的標準曲線建立及檢出限

采用1.3.3的方法，GSNO@AuNC對不同濃度的Hg2+進行了定量檢測，結果見圖4。

圖4 不同濃度的Hg2+對GSNO@AuNCs作用后的熒光光譜（A）及Hg2+與GSNO@AuNCs的熒光猝滅的線性關系（B）Fig.4 Fluorescence spectra of GSNO@AuNCs after different Hg2+concentrations reaction(A),and linear relationship of the fluorescence quenching of GSNO@AuNCs with Hg2+

由圖4A可知，不同濃度的Hg2+對GSNO@Au NCs作用后的熒光光譜可知，GSNO@AuNC在635 nm處的熒光強度隨著Hg2+濃度的增加而減小，這是由于Hg2+與金納米團簇發生了特異性聚集作用導致熒光猝滅。由圖4B可知，汞離子溶液濃度（X）與GSNO@AuNC熒光強度的差值（Y）在0.1～40μmol/L范圍內呈良好的線性關系，線性方程為Y=1.392+27.28X，相關系數R2=0.999 5。采用1.3.4的方法測得Hg2+的理論最低檢測限為0.033μmol/L。

2.4 金屬離子對GSNO@Au NCs檢測Hg2+干擾實驗

為了考察GSNO@Au NCs對Hg2+檢測的抗干擾性，對可能存在的干擾金屬離子進行干擾性實驗，結果見圖5。

圖5 共存金屬離子對Hg2+測定的影響Fig.5 Effect of the co-exiting metal ions on detection of Hg2+

由圖5可知，與Hg2+相比所加入的這些金屬離子未能引起體系明顯的熒光猝滅效應，證實了本方法中GSNO@Au NCs作為熒光探針對Hg2+具有選擇性。

2.5 精密度及加標回收率實驗[20]

為了評估GSNO@AuNC檢測Hg2+的實用性，選取市售常見紅茶、綠茶、茉莉花茶和普洱茶四類樣本進行了精密度及加標回收率實驗，結果見表1。

表1 加標回收率實驗結果Table 1 Results of adding standard recovery experiment

結果表明，加標回收率為98.5%～105.5%，相對標準偏差為6.6%～8.5%，表明該檢測方法的精密度及準確度良好。

3 結論

本實驗通過S-亞硝基谷胱甘肽作為保護劑和還原劑，合成了穩定性高和熒光強度良好的水溶性金納米團簇GSNO@AuNC。在最佳優化條件下（25℃，pH 7.0，反應時間為10min），GSNO@AuNCs能有效地使Hg2+的熒光強度猝滅，而且不受Na+、Cu2+、Pb2+、Mg2+、Ni2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cd2+、Ba2+、Al3+、Cr3+、Fe3+等離子干擾。汞離子濃度在0.1～40.0μmol/L范圍內與GSNO@AuNCs的熒光強度呈良好的線性關系，線性回歸方程為Y=1.392+27.28X，相關系數R2=0.999 5，檢出限為0.033μmol/L。在實際茶葉樣品中汞離子檢測中加標回收率為98.5%～105.5%，相對標準偏差為6.6%～8.5%，證明該檢測方法有良好的精密度及可靠性。研究成功建立了快速靈敏檢測茶葉中汞含量的方法，具有一定的發展前景和推廣價值。