高寒草甸優勢禾草-異針茅內生真菌的分離與鑒定

鮑根生，俞永飛，李春杰

(1.省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海大學，青海 西寧 810003；2.青藏高原優良牧草種質資源研究重點實驗室，青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016；3.蘭州大學草地農業科技學院,草地農業教育部工程研究中心，甘肅 蘭州 730020)

異針茅 (Stipaaliena) 隸屬禾本科針茅屬植物，是青藏高原高寒草甸植物群落的重要伴生禾草，主要分布在我國西藏東北部、青海高原、四川阿壩、甘肅南部等高海拔地區。異針茅是青藏高原地區重要的鄉土草種之一，具有較強的耐旱、耐寒能力和耐牧性等特點；同時，莖葉柔軟，適口性好，營養價值高，成為草食家畜主要可食的牧草之一[1]。

青海高原是青藏高原的重要組成部分，成為地球上最獨特的地質-地理-生態單元，地理環境的特異性決定該區域分布植物種類的多樣性和遺傳特性的特異性[2]。青海高原的植物種群大多分布于荒漠草原和干旱草原地帶，植物在極端環境條件下能頑強的生存，除與自身具有特有的遺傳特性有關外[3-4]；同時，也與植物共生的細菌、真菌、叢枝菌根等微生物相關，共生微生物能提高植物對寒冷、干旱等極端環境的耐受能力[5-8]。孫海群[9]對青海高原禾本科植物資源調查發現，禾本科植物有55屬，246種；同時，鮑根生等[10]對青海高原部分地區禾本科植物感染內生真菌現狀調查發現，26種植物感染Epichloё屬內生真菌。Epichloё內生真菌是指在宿主(冷季型禾草)體內度過全部或大部分生命周期，而宿主不出現外部癥狀的一大類真菌[11]；Leuchtmann等[12]根據內生真菌形態特征和擴增基因序列差異對現已報道的內生真菌重新命名為43種Epichloё屬內生真菌。大量研究結果表明，Epichloё內生真菌與宿主間建立互利共生關系，主要表現在：一方面宿主為內生真菌提供生存空間并供給生長所需要的營養物質，另一方面內生真菌可以促進宿主植物生長、降低草食家畜對宿主的采食頻次、提高宿主對非生物環境脅迫的耐受能力[13-15]。近年來，國內學者對中國境內禾草內生真菌分布和分類開展了大量研究。南志標[16]對西北部分地區22屬48種禾本科植物種子中的內生真菌進行了檢測，發現我國原產和國外引進的共7屬13種禾本科草種中存在內生真菌。Wei等[17]對中國北方部分地區的禾本科植物內生真菌進行了調查，共檢測了41種禾本科植物發現11屬26種禾本科植物中含有內生真菌；鮑根生等[10]研究表明青海地區有12屬27種禾本科植物感染Epichloё屬內生真菌；同時，分別從醉馬草(Achnatheruminebrians)、羽茅(Achnatherumsibiricum)、小穎羊茅(Festucaparvigluma)、拂子茅(Calamagrostisepigeios)、鵝觀草(Roegneriakamoji)、草地早熟禾(Poapratensis)、鼠茅(Vulpiamyuros)、大雀麥(Bromusmagnus)和羊草(Leymuschinensis)中分離并鑒定出8個新種[18-25]，而且新的內生真菌資源不斷被發現，說明我國存在豐富的內生真菌資源。

目前為止，采用形態學特征結合測序構建系統發育樹的方法共鑒定43種禾草內生真菌[12]。其中，編碼蛋白(tub)、轉錄延長因子(tef)、肌動蛋白(actin)基因序列分析被廣泛應用于Epichloё屬內生真菌的鑒定和系統發育關系推斷[12]。例如，張晨煒等[26]發現犬草(Roegneriacanina)感染的內生真菌種類為Epichloёsinicum；曠宇等[27]對中國西北部8個地理種群的中華羊茅(Festucasinensis)感染的內生真菌分離，發現中華羊茅感染的內生真菌均為Epichloё屬內生真菌；鮑根生等[28]研究表明紫花針茅(Stipapurpurea)感染的內生真菌分別為Epichloёchisosa、E.gansuensis和E.inebrians；Song等[29]研究發現中國西部9種披堿草屬植物感染的內生真菌為Epichloёbromicola。Zhu等[20]發現羊草所攜帶Epichloё內生真菌鑒定為Epichloёbromicola。紀燕玲等[30]將葦狀羊茅(Festucaarundinacea)所攜帶Epichloё內生真菌鑒定為Epichloёuncinatum。目前，針對異針茅的研究主要集中于種群補償生長要素[31]、引種試驗及草地群落方面的研究[1,32]，但有關異針茅內生真菌方面的研究較少，經檢測發現青海高原地區異針茅內生真菌侵染率較高(≥80%)[10]。因此，本研究以青海高原地區兩個地理種群中感染內生真菌的異針茅為研究對象，通過觀察和分析異針茅形態學特征，確定異針茅感染的內生真菌是否符合Epichloё屬內生真菌形態特征；利用tub、tef、actin基因序列構建系統發育樹，明確異針茅感染內生真菌的分類地位，并結合形態學特征最終確定異針茅感染內生真菌的種類，為以后異針茅禾草內生真菌共生體在青藏高原特有微生物資源開發和利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2017年9月下旬在青海省玉樹藏族自治州稱多縣和青海省海南州同德縣同德牧場天然草地上采集異針茅植物樣品，每個樣點每隔100 m，隨機采集10～20株異針茅單株，將地上部分放入編號的信封中帶回實驗室。

1.2 帶菌率檢測

異針茅內生真菌帶菌率的檢測采用種子苯胺藍染色檢測的方法，具體方法是：在室溫條件下(15～22 ℃)，用5%氫氧化鈉溶液將種子浸泡過夜。翌日，將浸泡后的種子用蒸餾水漂洗數次，將種子置于苯胺藍溶液中靜置1 h。將染色的種子置于載玻片上，在40倍目鏡下觀察內生真菌菌絲。如果種皮或糊粉層中出現光滑的深藍色菌絲，確認異針茅被內生真菌所侵染。

1.3 內生真菌分離與培養

參照Song等[29]的方法進行異針茅植株感染內生真菌的分離，具體操作方法如下：每個單株挑選5粒種子并進行表面消毒，用無菌水沖洗3～5次后將種子置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基上。真菌培養箱25 ℃黑暗環境中培養30 d，在種子表面形成菌落后，挑取少量菌絲體并在PDA培養基上培養。待產生分生孢子后，挑取單個分生孢子并在25 ℃黑暗環境中進行純培養。每周測量菌落直徑，4周后測量分生孢子和分生孢子梗大小。

1.4 內生真菌DNA的提取

用無菌刀片刮取菌絲體，加入少量石英砂研磨，將研磨后的粉末全部加入1.5 mL離心管中，根據真菌DNA提取試劑盒(HP Fungal DNA Kit(50)D3195-01)的說明書提取方法提取異針茅所感染的內生真菌DNA，并將提取的DNA進行凝膠電泳并儲存在4 ℃的冰箱中備用。

1.5 利用tub、tef、actin三個管家基因確定異針茅內生真菌種類

在NCBI基因數據庫Blast程序中搜索與異針茅tub、tef和actin序列直系同源性較高序列，挑選代表性序列并利用MEGA 6.0進行比對。將比對結果使用PAUP*4.0b 10軟件構建系統發育樹[33]。系統發育樹選取以Claviceps purpurea(AF276508，AF276509和AF062646)作為外群的序列。

2 結果與分析

2.1 異針茅內生真菌形態特征

從玉樹藏族自治州稱多縣和海南州同德縣同德牧場兩個異針茅地理種群分別挑選的10株單株內生真菌帶菌率為81%和90%。同時，從20個單株中成功分離出3株內生真菌菌株；其中，玉樹異針茅種群分離內生真菌編號為Yssa 5和Yssa 9，從同德異針茅地理種群分離內生真菌編號為Tdsa。25 ℃黑暗條件培養下，PDA培養基上菌落生長緩慢，平均生長速率為0.524 mm·周-1；其中，Yssa 5編號(圖1A，B)的菌落正面氣生菌絲分布稀疏，白色。邊緣暗黃色蠟狀環，反面黃色；Tdsa編號(圖1D～E)菌落正面菌落白色，氣生菌絲發達由中央向四周變稀疏，反面淡黃褐色，由中央向邊緣變淺；Yssa 9編號(圖1G～H)菌落正面氣生菌絲稀疏，表面呈奶黃色，邊緣有蠟質，中心凹起，反面暗褐色，邊緣顏色變淺。分生孢子單生于分生孢子梗頂端，橢圓形、腎形、彎月形、梨形，3種編號的分生孢子平均大小為3.247 μm×6.628 μm；分生孢子梗基部單生或基部生成兩個分支，平均長為26.669 μm，基部寬為2.721 μm，頂端寬為0.980 μm (圖 1C、F、I)。以上特征均符合Epichloё屬內生真菌特征。

圖1 異針茅PDA菌落形態、分生孢子梗和分生孢子結構Fig.1 Photographs of hyphae, colony and conidial morphology isolated endophytes from S. aliena A～C: Yssa 5菌落正反面形態，分生孢子和分生孢子梗形態; D～F: Tdsa菌落正反面形態，分生孢子和分生孢子梗形態; G～I: Yssa 9菌落正反面形態，分生孢子和分生孢子梗形態。菌落大小標尺長度為10 mm，分生孢子和分生孢子梗大小標尺長度為20 μm。A-C: Morphology characteristics of colony, conidial isolated from Yssa 5； D-F: Morphology characteristics of colony and conidial isolated from Tdsa; G-I: Morphology characteristics of colony and conidial isolated from Yssa 9; Length of scale bar for colony pictures was 10 mm, and for conidia pictures was 20 μm.

2.2 系統發育分析

以異針茅分離內生真菌的總DNA為模板，利用tub、tef、actin3個管家基因為引物分別擴增目的片段基因。通過NCBI比對后，分別抽取60、60、59條禾草內生真菌tub、tef、actin序列。構建tub系統發育樹的序列比對后長度為864 bp，其中包括365個保守位點、466個變異位點和250個簡約位點；構建tef系統發育樹的序列比對后長度為607 bp，其中包括226個保守位點、372個變異位點和209個簡約位點；構建actin系統發育樹的序列比對后長度為659 bp，其中包括305個保守位點、348個變異位點和193個簡約位點。

tub、tef和actin序列構建的系統發育樹顯示(圖2～4)，異針茅分離的菌株Tdsa與我國醉馬草感染的E.gansuensis和E.inebrians明顯聚成一條分支；而菌株Yssa 5和Yssa 9與分離于短柄草(Brachypodiumsylvaticum)感染的E.sylvatica聚到一起，自展值分別高達87%、99%和98%。

3 討論

本研究發現兩個地理種群的異針茅內生真菌的感染率高達80%以上，說明青海高原地區異針茅與內生真菌共生的現象比較普遍。同時，異針茅所感染的內生真菌種類出現差異，造成這種現象的原因可能為內生真菌對冷季型禾草侵染的概率較高，且禾本科植物內生真菌與冷季型禾草形成穩定的互利共生關系[13,34]。本研究中異針茅樣品采集于青海高原地區，其地理環境和氣候表現出高海拔、年積溫低和植物生長季短等特征[35]；內生真菌侵染能提高異針茅對高寒極地環境的適應性，增強對病蟲害的抵抗能力和降低草食家畜的采食頻次[36]。本研究通過對兩個地理種群異針茅所感染內生真菌的菌落顏色、質地、生長速率、分生孢子大小等形態學特征的觀測，發現異針茅感染內生真菌菌落在PDA培養基上的形態和生長特征出現差異，表現出形態多樣性(圖1)。異針茅菌株在同一培養條件下所出現的外部形態特征差異，主要取決于自身的遺傳組成特征，同時也是遺傳多樣性的外在表現形式[37]。筆者先后對紫花針茅、睡眠草(Achnatuerumrobustum)、豎針茅(Achnatuerumeminens)、羽茅、羊草、醉馬草等禾草所感染的內生真菌的菌落形態、菌落生長速度、分生孢子大小和分生孢子梗長度進行形態學觀察，并輔以分子測序手段構建系統發育樹，將它們所攜帶的內生真菌鑒定為不同的Epichloё屬內生真菌[18-20,23,28,38]，發現上述大多數禾草所感染的Epichloё內生真菌表現為宿主特異性，而部分禾草種類攜帶的Epichloё內生真菌表現出多樣性特征。例如：從紫花針茅中分離得到E.chisosa、E.inebrians和E.gansuensis3種內生真菌[28]；中國醉馬草中分離得到E.gansuensis和E.inebrian兩種內生真菌[18]；內蒙古羽茅中分離得到E.gansuense和E.sibiricum兩種內生真菌等[19]，這幾類禾草攜帶的Epichloё內生真菌均表現出多樣性特征，本研究所得的結論與上述研究結果一致。導致冷季型禾草感染內生真菌形態多樣性的主要原因為：1)冷季型禾草主要分布于高原地帶，系寒旱生植物；而冷季型禾草通常為Epichloё屬內生真菌主要宿主；同時，內生真菌侵染可以提高禾草對高寒極地環境的適應性[39]； 另外， 極地環境也對生長于該區域的物種形態特性具有較高的可塑性[40]。例如，陳釗等[41]研究不同海拔披堿草(Elymusdahuricus)形態特征的可塑性發現，隨著海拔的升高，披堿草高度、旗葉長度和穗長呈下降趨勢；而穎片長度、外稃長和芒長隨著海拔的升高呈上升趨勢。2)冷季型禾草與其侵染的內生真菌所形成的共生體是雙方長期適應性進化的結果，由于禾草內生真菌共生體生存環境，冷季型禾草和內生真菌基因型的差異，造成宿主植物感染內生真菌的形態特征出現差異[36,42]；3)體外分離培養條件等的差異造成內生真菌的形態多樣性[43]。這也從另一個角度反映出：形態學分類很難準確地反映內生真菌的分類學地位。

圖3 異針茅(tef)內生真菌系統進化最大簡約樹Fig.3 Molecular phylogeny derived from ML analysis of introns of tef gene from related Epichloё species and S. aliena 樹長The length of phylogeny=607 bp; 一致性指數Consistency index(CI)=0.873; 保留指數Retention index(RI)=0.905; 復定一致性指數Rescaled consistency index(RC)=0.887. 將Claviceps purpurea AF276508作為外群 Claviceps purpurea (AF276508) was designated as the outgroup for rooting trees.

圖4 異針茅(actin)內生真菌系統進化最大簡約樹Fig.4 Molecular phylogeny derived from ML analysis of introns of actin gene from related Epichloё species and Stipa aliena 樹長The length of phylogeny=659 bp; 一致性指數Consistency index(CI)=0.876; 保留指數Retention index(RI)=0.923; 復定一致性指數Rescaled consistency index(RC)=0.809. 將Claviceps purpurea AF276509作為外群。 Claviceps purpurea (AF276509) was designated as the outgroup for rooting trees.

目前，管家基因表達水平受環境因素影響較小，而且是在個體各個生長階段的大多數或幾乎全部組織中高度保守且持續表達，因此管家基因常被用于分子技術—多位點基因分析[12]。本研究中，采用編碼蛋白(tub)、轉錄延長因子(tef)和肌動蛋白(actin)3種管家基因對異針茅感染的內生真菌基因組進行擴增，結合已經公布的針茅族和其他Epichloё屬內生真菌序列構建系統發育樹，發現Yssa 5和Yssa 9(圖2～4)與短柄草分離的有性態內生真菌E.sylvatica形成明顯的分支；而Tdsa菌株所得序列與醉馬草分離的無性態內生真菌E.gansuensis組成另外一個分支(圖2和圖4)，同時還與醉馬草分離的無性態內生真菌E.inebrians組成一個分支(圖3)；所以將異針茅所感染的內生真菌暫鑒定為E.gansuensis、E.inebrians、E.sylvatica。可見，異針茅內生真菌表現出宿主非特異性，這與前人在其他冷季型禾草內生真菌分離和鑒定的研究結果相近[19-20,28,38]。例如：李偉等[44]分析22株Epichloё內生真菌的遺傳多樣性，發現這些菌株之間存在一定的遺傳多樣性。陳永敢等[45]利用PAPD標記對我國Epichloё內生真菌進行了真菌種類、宿主種類、采集地和菌株間的遺傳多樣性探討，結果表明遺傳多樣性豐富，許多不同宿主的菌株獨立聚類；同時，不同地理環境、不同種類的菌株聚類也不同。Zhu等[20]研究發現內蒙古羽茅同時感染E.gansuense和E.sibiricum兩種內生真菌；Moon等[38]也從南美洲刺猬草(Echinopogonovatus)體內分離出兩種Epichloё內生真菌。對于出現一種禾草攜帶多種內生真菌的情況，筆者對此現象展開了探討，并且認為出現這種現象的可能原因在于：1)禾草內生真菌的傳播方式主要為靠種子傳播的垂直傳播和靠分生孢子傳播的水平傳播；在自然環境下，牛羊啃食活動會給宿主葉片和莖稈造成機械傷口，這將為靠水平傳播為主內生真菌的分生孢子提供侵染機會，造成原本以垂直傳播為主的內生真菌共生體感染同域以水平傳播為主的其他種類的內生真菌，并最終形成宿主感染的內生真菌出現多樣性[46]。2)部分禾草內生真菌的基因組保持較高的變異位點，導致其Epichloё內生真菌存在基因多樣性。例如：Zhang等[19]發現內蒙古羽茅同時感染E.sibiricum和E.gansuense內生真菌，并且發現一些內生真菌是雜合，表明可能存在不同羽茅內生真菌種群間的雜交現象。本研究中異針茅內生真菌基因組的變異位點高于保守位點和簡約位點，導致異針茅可能出現了感染不同內生真菌的現象。3)宿主間的親緣關系和感染內生真菌的非特異性，造成同一宿主可能感染不同種類的內生真菌。醉馬草和異針茅同屬針茅族且分布地理環境相似[10,47]，說明異針茅與醉馬草可能存在一定的親緣關系。例如，醉馬草感染的兩種無性態內生真菌可以通過宿主跳躍方式感染異針茅[48]，進而使異針茅感染E.gansuensis和E.inebrians兩類內生真菌。而短柄草感染的內生真菌屬于有性態內生真菌[12]，且短柄草多分布于溫帶和熱帶地區[49]，與異針茅的分布環境出現較大的差異，筆者推斷異針茅與短柄草無親緣關系。而異針茅攜帶的E.sylvatica與短柄草感染的是同一個內生真菌，表明異針茅攜帶的E.sylvatica可能是內生真菌出現宿主非專一性，出現這種現象的原因可能與異針茅出現混合進化狀態有關，即異針茅可能同時出現有性態和無性態內生真菌種類[50]。

綜上所述，異針茅所感染的內生真菌初步鑒定為E.gansuensis、E.inebrians、E.sylvatica，異針茅與內生真菌間未形成嚴格的宿主特異性，表現出內生真菌多樣性，這可能與生長環境、宿主和感染的內生真菌基因型等因素有關。由于本研究僅對青海高原兩個地理種群異針茅的內生真菌進行形態觀測和系統發育樹構建，且未進行多個樣本基因組多樣性的分析；所以，后續的研究還需要擴大異針茅的檢測范圍，以及需要進一步驗證異針茅內生真菌基因多樣性，以此來揭示異針茅內生真菌的起源和分化過程。