青海高寒草地針茅根際土壤細菌拮抗功能評價及鑒定

劉雪兒，馬金鳳，楊成德，李統華

(甘肅農業大學植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

不科學的使用化學農藥，導致農產品中農藥殘留量超標，影響生態平衡，加劇“3R”問題，并且使病原物產生抗藥性[1]，這與生態農業的目標相悖。生物防治主要利用有益微生物對病原菌的拮抗作用來減少病原物的數量和削弱其致病性，同時誘導或增強植物抗病性[2]。目前國內在黃瓜枯萎病(Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum)[3]、西瓜枯萎病(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)[4]、甜菜根腐病(Fusariumspp.)[5]和煙草黑脛病(Phytophthoranicotianae)[6]等作物土傳病害生物防治研究較多。根際指植物根系與土壤微生物之間相互作用所形成的獨特圈帶[7]；根際微生物是在植物根系直接影響的土壤范圍內生長繁殖的微生物，與植物關系密切，種類繁多[8]，且不同植物、不同耕作方式，土壤細菌的群落組成也不盡相同[9-12]，其中存在許多對植物有益的細菌群落，包括生防細菌、能生產植物生長激素的細菌和固氮菌等[9]，是微生物資源寶庫之一。針茅屬(Stipa)植物屬于旱生、中旱生、廣旱生密叢型禾草，在中國主要分布于內蒙古高原、黃土高原、青藏高原及新疆阿爾泰山和天山等山地[13]，其中異針茅(S.aliena)和疏花針茅(S.penillata)主要分布于較濕潤的高寒地區，是組成高寒草甸草原的主要優勢種，本氏針茅(S.capillata)是一種較喜暖的旱生叢生禾草，是我國暖溫型典型草原的建群種，紫花針茅(S.purpurea)是青藏高原的特有成分，廣泛分布于青藏高原海拔 4500～5200 m 的高原及山地，最高可達到5400 m[13]，在這種極端生境下其根際土壤細菌是否豐富？拮抗功能是否強大？因此，本試驗以青海高寒草地針茅根際土壤細菌為研究對象，以番茄早疫病菌(Alternariasolani)、馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)、馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata)和馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)為指示菌評價其拮抗能力并進行鑒定，以期為青海高寒草地針茅根際土壤細菌的開發提供依據，也為農業生防菌劑的開發提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試土樣及菌種 供試土樣：于2016年8月在青海省海晏縣青海湖鄉達五德吉村(東經100°52′42″，北緯37°04′08″)采集異針茅、疏花針茅、本氏針茅和紫花針茅根際土壤樣品，隨機挖取5叢植株及根系周圍土壤帶回實驗室，將植株根系從土壤中輕輕分出，抖落其表面土壤視為根際土立即進行分離培養。

供試病原菌：番茄早疫病菌、馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌和馬鈴薯炭疽病菌均由甘肅農業大學植物保護學院植物病原細菌及細菌多樣性實驗室提供。

1.1.2供試培養基[14]牛肉膏蛋白胨(NA)培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨6 g、葡萄糖15 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L;LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 L，用于根際土壤細菌分離培養。

馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，用于病原真菌培養及對峙培養。

1.2 試驗方法

1.2.1土壤細菌的分離及純化 將10 g土樣，置于盛有90 mL無菌水的三角瓶中，在28 ℃搖床上振蕩約30 min，逐級稀釋至10-4和10-5mol ·L-1，分別取各濃度對應的土壤懸浮液0.1 mL 均勻涂布于固體LB平板上，每個濃度梯度重復3次，28 ℃條件下培養48 h；統計所有重復的菌落數并挑選其培養特征明顯相異的單個菌落，于LB平板進行劃線純化，后于4 ℃保存備用[15]。

1.2.2土壤細菌培養形狀及形態觀察 將土壤細菌接種于NA培養基，置于28 ℃培養箱中培養72 h，觀察單菌落形態特征并描述；將活化18 h后的菌株進行革蘭氏染色，觀察菌體顏色和形態，并進行大小測量(30個)和顯微拍照[14]。

1.2.3拮抗功能評價 采用平板對峙培養法[16]評價土壤細菌對4種指示菌的拮抗能力。首先，用直徑為6 mm的打孔器在4種指示菌平板邊緣打孔，并將指示菌菌餅接入PDA平板中央，其次，用無菌牙簽在病原菌菌餅周圍2.5 cm等距離接種待測細菌，每處理重復3次，馬鈴薯壞疽病菌置于15 ℃培養，其他3種指示菌于28 ℃條件下培養，直至對照菌落滿皿后用十字交叉法測量抑菌直徑并計算抑菌率。

抑菌率=(對照的菌落直徑-處理的菌落直徑)/(對照的菌落直徑-菌餅直徑)×100%

1.2.416S rDNA鑒定 土壤細菌活化后在LB培養液中振蕩過夜培養，后按天根生化科技有限公司試劑盒(離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒)提取DNA，利用16S rDNA通用引物：引物27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和引物 1492 R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′進行PCR擴增[16]；PCR擴增體系為50 μL，其中DNA模板2 μL，Master Mix 25 μL，1492R 2 μL，27F 2 μL，ddH2O 19 μL。

PCR反應條件為94 ℃ 4 min預變性，之后94 ℃ 30 s變性、60 ℃ 30 s退火、72 ℃ 90 s延伸，共30個循環，再72 ℃ 10 min延伸完成擴增。將PCR擴增產物送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序，所測序列與GenBank數據庫中已知序列進行比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)并用Mega 7.0軟件構建系統發育樹，明確其系統發育關系。

1.3 數據分析

運用 Excel 2010統計分析并處理數據，并用Mega 7.0軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌的分離和純化

將青海采集的異針茅、本氏針茅、紫花針茅和疏花針茅根際土壤樣品經稀釋分離培養，在10-5mol·L-1濃度下, 能夠形成清晰獨立的菌落。統計結果表明，該生境土壤細菌數量較豐富，菌落數介于106～107cfu·g-1(表1)。

表1 針茅屬根際土壤細菌數Table 1 Soil bacteria amounts of the Stipa rhizosphere (cfu·g-1)

根據培養性狀，異針茅根際土壤樣品中分離到8株土壤細菌，分別編號為3T1至3T8；本氏針茅根際土壤樣品中分離到6株土壤細菌，分別編號為4T1、4T2、4T3、4T4、4T5和4T7；紫花針茅根際土壤樣品中分離到6株土壤細菌，分別編號為5T1、5T2、5T3、5T6、5T7和5T8；疏花針茅根際土壤樣品中分離得到3株土壤細菌，分別編號為10T1至10T3。共分離得到23株菌株，保存備用，但在研究過程中6株菌株失活，不能再繼代培養。

2.2 培養形狀及形態觀察

2.2.1培養形狀觀察 根據表2，異針茅根際土壤細菌菌落均為圓形，菌落大小為2～6 mm，除3T5表面無光澤外，其他表面都有光澤且凸起，基本不透明，菌落顏色為乳白色或乳黃色；本氏針茅根際土壤細菌除4T3菌落為不規則形外其他均為圓形，菌落大小為0.1～8.5 mm，4T3和4T5表面無光澤，其他表面都有光澤且凸起，基本不透明，菌落顏色為白色或黃色；紫花針茅根際土壤細菌菌落均為圓形，菌落大小為2～5 mm，5T2表面無光澤，其他表面都有光澤且凸起，基本不透明，菌落顏色為白色或者黃色；疏花針茅根際土壤細菌中，10T1菌落為不規則形其余都為圓形，菌落大小為2～6 mm，10T1表面無光澤且平展，其他表面都有光澤且凸起，基本不透明，菌落顏色為白色或者黃色。該結果表明青海高寒草地不同種針茅根際土壤細菌培養性狀差異明顯。

2.2.2形態觀察 23株土壤細菌均呈革蘭氏陽性，桿狀(表3)。異針茅根際土壤細菌菌體差別明顯，其中3T7菌體最長，達9.98 μm，3T6菌體最寬， 為2.93 μm，其他菌株介于兩者間； 本氏針茅根際土壤細菌中菌體最長和最寬的菌株分別為4T5和4T3，分別達9.91和3.03 μm，其他菌株介于兩者間；在紫花針茅根際土壤細菌中，菌體最長和最寬的菌株均為5T2，分別為10.5和2.37 μm，其他菌株介于兩者間；疏花針茅根際土壤細菌10T1菌體最長，為6.04 μm，10T3菌體最寬，為1.72 μm，其他菌株介于兩者間。總體看，針茅屬不同種根際土壤細菌表現出明顯的形態差異。

G+: 革蘭氏陽性 Gram-positive bacteria.

2.3 拮抗功能評價

結果表明，青海高寒草地異針茅、本氏針茅、紫花針茅和疏花針茅根際土壤細菌中拮抗菌所占比例為0、17%、17%和67%，其中具有強拮抗能力的菌株為4T1、5T1、10T1和10T3，特別是10T1對番茄早疫病菌、馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌和馬鈴薯炭疽病菌的抑菌率分別為67.14%、68.57%、61.43%和75.71%(圖1，表4)?？傮w看高寒草地針茅根際土壤細菌中具有較多拮抗菌株，且抑菌能力強，抑菌譜較廣，但不同種間根際土壤細菌拮抗能力有差異。

表4 優良拮抗土壤細菌的抑菌作用Table 4 Antagonistic effect of excellent antagonistic soil bacteria (%)

圖1 10T1的抑菌作用Fig.1 The antagonistic effect of 10T1 A: 番茄早疫病菌A. solani; B: 馬鈴薯壞疽病菌P. foveata; C: 馬鈴薯炭疽病菌C. coccodes; D: 馬鈴薯枯萎病菌F. avenaceum.

2.4 16S rDNA序列分析

對17株可以繼代培養的菌株經PCR擴增和測序，于GenBank數據庫中進行序列比對和構建系統發育樹，并結合培養性狀和形態特征，將此17株菌鑒定為7屬12種(表5)，其中8株土壤細菌鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，其中3T2和4T5為簡單芽孢桿菌(B.simplex)、4T2和4T3為蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、10T1為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、5T2為蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、3T5為維德曼芽孢桿菌(B.wiedmannii)，3T8為韋氏芽孢桿菌(B.weihenstephanensis)，占總株數的47.05%，為優勢屬。另外，將3T4、3T7和4T7鑒定為嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，3T6鑒定為摩拉維亞假單胞菌(Pseudomonasmoraviensis)，5T3和10T2鑒定為乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoacetius)，4T1鑒定為成團泛菌(Pantoeaagglomerans)，5T7鑒定為藤黃微球菌(Micrococcusluteus)，5T8鑒定為氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans)(圖2)。

表5 針茅屬不同根際土壤細菌的種類Table 5 Soil bacteria types of the Stipa rhizosphere

圖2 針茅屬根際土壤細菌系統發育樹Fig.2 Soil bacteria phylogenetic tree of the Stipa rhizosphere

異針茅根際土樣中共分離到6株菌，其中3株為芽孢桿菌屬，2株為寡養食單胞菌屬，1株為假單胞菌屬，且假單胞菌屬為異針茅所特有(表5)；本氏針茅根際土樣中分離到5株菌，其中3株為芽孢桿菌屬，1株為寡養食單胞菌屬，1株為泛菌屬，且泛菌屬為本氏針茅所特有；紫花針茅根際土樣中4株菌，分別屬于芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、微球菌屬和微桿菌屬；疏花針茅根際土樣中的2株菌分別屬于芽孢桿菌屬和不動桿菌屬。

3 討論與結論

土壤細菌是土壤中最豐富，分布最廣泛的微生物類群[17-18]，在農業生產中又可分為有益和有害細菌。為了農業高產穩產，人們對有益細菌進行了大量研究。早在1962年，張憲武等[19]已開始大豆(Glycinemax)根際土壤細菌的研究，但是有關高寒極端生境土壤細菌的研究報道較少。種植地區、耕作方式及作物種類等因素不同，土壤細菌的數量也存在差異。李榮坦等[20]研究低磷脅迫對番茄(Solanumlycopersicum)根際土壤細菌多樣性的影響，發現低磷脅迫處理下，“紅寶石1號”根際可培養細菌數量最多，為40.32×106cfu·g-1；江曙等[21]對不同地區當歸(Angelicasinensis)根際微生物種群結構進行研究，發現在當歸生長過程中，微生物數量逐漸增加，10月以后又開始下降，且岷當歸根際中分離到36株細菌，細菌數量最多時達(124.6±6.8)×106cfu·g-1。本試驗所研究的針茅根際土壤中分離的細菌數量介于6.4×106～36.0×106cfu·g-1，與以上文獻報道基本一致。

高明華等[22]對呼倫貝爾草甸草原優勢種群羊草(Leymuschinensis)根際微生物進行了研究，結果顯示，羊草根際土壤中共分離得到36株細菌，分屬于7個屬，其中芽孢桿菌屬17株；周陽薇等[23]對12種不同植物根際的土壤細菌進行了分離，并初步確定了細菌的分類地位，共得到137株細菌，分屬于8個屬，且芽孢桿菌屬為優勢屬，占81.0%。而本試驗從4份針茅根際土樣中分離得到23株細菌，17株可轉代，分屬于7個屬，其中芽孢桿菌屬8株，為優勢屬，從菌株數看較少，但屬數與上述文獻基本一致。

生防細菌具有繁殖速度快、代謝產物復雜多樣、與病原菌作用方式廣、易于培養等特點，且生防芽孢桿菌抗逆性強，具有良好的生防效果[24]。據報道蘇云金芽孢桿菌[25]、蠟狀芽孢桿菌[26]和解淀粉芽孢桿菌[27]均具有良好的生物防治作用，其中蘇云金芽孢桿菌常用來防治各種農業害蟲和植物寄生線蟲，蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌常用來防治各種植物病害。本試驗共分離得到23株細菌，其中4株具有強抑菌作用，特別是疏花針茅根際菌株10T1對番茄早疫病菌、馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌和馬鈴薯炭疽病菌的抑菌率分別為67.14%、68.57%、 61.43%和75.71%，并將其初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌。馮中紅等[28]從東祁連山高寒草地牧草分離篩選的內生細菌解淀粉芽孢桿菌264ZY7對馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯枯萎病菌的抑菌率分別為38.17%和49.60%；馮金龍等[29]報道解淀粉芽孢桿菌S27對馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯炭疽病菌都有良好的抑菌效果，其中對馬鈴薯炭疽病菌的抑菌率為75%；暢濤等[30]報道解淀粉芽孢桿菌B-401對馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯炭疽病菌和番茄早疫病菌的抑菌率分別為74.45%、70.05%和60.25%。此外，還有報道解淀粉芽孢桿菌可以防治番茄枯萎病[24]、玉米(Zeamays)紋枯病[31]、絲瓜(Luffacylindrica)炭疽病[32]和草莓(Fragariaananassa)灰霉病[33]等植物病害。本試驗所分離的解淀粉芽孢桿菌10T1具有廣譜抑菌作用，對馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯枯萎病菌的抑菌率高于馮中紅等[28]的報道，與馮金龍等[29]和暢濤等[30]的報道基本一致，對番茄早疫病菌的抑菌率高于暢濤等[30]的報道，說明菌株10T1抑菌譜寬，抑菌能力強，有被開發為良好的生防制劑的潛力。

隨著人們對極端環境微生物的深入了解，意識到極端生境微生物為適應極端環境形成了獨特的生物活性物質合成途徑或者代謝途徑，并能產生許多特殊的生物活性物質，有良好的開發前景，如嗜冷菌產生的低溫酶，在洗滌防治、食品加工、植物保護、環境保護等方面起著至關重要的作用[34]。本試驗所分離菌株均能在青海海拔高，氣候寒冷，溫度低的極端生境生存，抗逆能力強，可能具有良好的開發應用潛力。但本試驗僅對室內抑菌功能進行了測定，還需進一步研究其抑菌譜、抑菌機理及發酵條件等，為生防菌劑的開發奠定基礎。