四倍體馬鈴薯SRAP分子遺傳連鎖圖譜的構建

張明飛，于卓，于肖夏，李景偉，馬艷紅，吳國芳，王穎

(內蒙古農業大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)為菜、糧、飼兼用的四大重要作物之一，其塊莖富含淀粉、膳食纖維、蛋白質、維生素、礦物質、抗氧化酚類物質及花青素等成分[1]。在我國馬鈴薯主糧化戰略的驅動下，目前市場上對不同用途馬鈴薯品種的需求量呈增加趨勢，因此選育淀粉、全粉、薯條、薯片及富含花青素等加工專用型馬鈴薯新品種倍受重視[2-3]。構建植物遺傳連鎖圖譜是從正向遺傳學角度進行重要數量性狀基因座(quantitative trait locus，QTL)精細定位、功能基因克隆分析及分子標記輔助育種研究的基礎。

以往遺傳作圖多用擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)和簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)這兩種分子標記，不足點是AFLP操作技術復雜、SSR技術多態性標記數量有限。相關序列擴增多態性(sequence related amplified polymorphism，SRAP)是一種較新的二代分子標記技術，其原理是根據基因中啟動子和內含子的堿基AT含量豐富，外顯子中堿基GC含量豐富的特點來設計引物進行PCR擴增，因不同個體中的啟動子、內含子與間隔區長度不同而產生多態性[4]。SRAP標記具有通用性廣、共顯性高、多態性豐富、重復性好、易測序及操作簡便等優點[5-6]，已被應用于玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、棉花(Gossypiumspp.)及冰草(Agropyron)等植物的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構建等研究中[7-10]。

目前已有一些關于馬鈴薯遺傳作圖的研究報道，如荷蘭瓦赫寧根大學的Hans等[11]利用AFLP分子標記構建了第一張二倍體馬鈴薯的超密度遺傳連鎖圖譜，Bradshaw等[12]采用AFLP和SSR兩種標記構建了同源四倍體馬鈴薯的遺傳圖譜，金黎平等[13]用AFLP標記建立了我國第一張二倍體馬鈴薯遺傳圖譜，崔闊澍[14]利用AFLP和SSR分子標記構建了四倍體彩色馬鈴薯的高密度遺傳圖譜。迄今在國內外還未見用SRAP標記技術構建馬鈴薯遺傳連鎖圖譜的研究報道。

植物分子遺傳連鎖圖譜是進行其品質和產量等重要QTL定位的基礎，通常遺傳作圖要求親本間的遺傳差異大、雜交后代作圖群體目標性狀分離明顯。本試驗以四倍體馬鈴薯YSP-4×MIN-021雜種F1代182個分離單株為作圖群體，用SRAP分子標記技術和Join Map 4.0軟件構建馬鈴薯的SRAP分子遺傳連鎖圖譜，以期為馬鈴薯高淀粉、高干物質及產量等重要QTL定位、分子標記輔助育種及功能基因圖位克隆等研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與種植方式

材料為適應性很強的四倍體馬鈴薯YSP-4與干物質和淀粉含量高的四倍體馬鈴薯MIN-021雜交產生的F1代182個分離單株及其親本，由內蒙古農業大學馬鈴薯遺傳育種研究中心保存并提供。2018年5月種植在呼和浩特市托克托縣馬鈴薯育種基地的網棚中，株距為30 cm，行距為90 cm。土壤為沙質土，生長期間適時適量灌水施肥，以保證馬鈴薯正常生長發育對水和養分的需求。

1.2 DNA提取與質量檢測

在現蕾期，取182個馬鈴薯雜種F1代單株及其親本的幼嫩葉片用冰盒帶回實驗室，稱取1.5 g葉片，根據天根生化科技有限公司生產的植物基因組試劑盒說明提取各材料的基因組DNA。1.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度后，用日本島津產UV2401紫外分光光度計測定DNA濃度，稀釋至約50 ng·μL-1，置-20 ℃冰箱中備用。

1.3 引物來源

從Li等[4]、Pezzotti等[15]和Lin等[16]報道的SRAP引物中，隨機選取正向引物17條、反向引物21條，自由組合成357對引物，送至上海生物工程有限公司合成。

1.4 SRAP-PCR擴增及產物檢測

反應體系體積為20 μL，包括10×PCR Buffer(Mg2+)2.5 μL、2.5 mmol·L-1的dNTPs 1.6 μL、5 U·μL-1的Taq酶0.2 μL、10 mmol·L-1的正反向引物各1.2 μL、50 ng·μL-1的模板DNA 1 μL、ddH2O 12.3 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃下延伸1 min，循環5次；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃下延伸1 min，循環35次；72 ℃下延伸10 min后4 ℃保存。PCR產物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測[17]。

1.5 數據統計

1.5.1多態性位點統計 電泳膠板上，有條帶位點的記錄為“1”，無條帶位點的記錄為“0”，條帶位點不清晰或缺失的記錄為“-”，生成“0”和“1”組成的數據矩陣。計算多態性條帶位點百分率：

P=(K/N)×100%

式中:K表示多態性條帶位點數目；N表示檢測到條帶位點總數[18]。

1.5.2偏分離統計 根據孟德爾分離規律，四倍體馬鈴薯雜種F1代群體的SRAP標記多態性位點理論上應符合1∶1或3∶1的分離比，在P<0.01和P<0.05的水平上，對多態性位點進行卡方檢驗，判斷其是否發生偏分離并統計其偏分離標記數目。

1.5.3遺傳連鎖圖譜構建 采用Join Map 4.0軟件的“CP”作圖模型，用擴增得到的馬鈴薯分離類型為lm×ll(母本型1∶1)、np×nn(父本型1∶1)和hk×hk(雙親共有型3∶1)的SRAP標記，分別構建出馬鈴薯雙親的SRAP分子遺傳連鎖圖譜，本試驗設定的連鎖閾值(likelihood of odds, LOD)范圍為3.0～5.0。

2 結果與分析

2.1 引物篩選及分子標記多態性分析

隨機取馬鈴薯YSP-4×MIN-021雜種F1代分離群體中的3個單株和雙親DNA作模板，進行SRAP適宜性引物篩選(圖1)。從357對引物中篩選出條帶穩定清晰、多態性豐富的引物36對(表1)，利用這些引物對182個雜種F1分離單株的基因組DNA擴增得到742個條帶位點，多態性條帶位點為598個，多態性比率為80.59%，平均每對引物擴增出多態性位點16.61個，表明F1分離群體的多態性較豐富，遺傳差異較大(圖2)。

圖1 供試材料部分SARP適宜引物的篩選Fig.1 Screening of partial suitable SRAP primers in test materials P1: 母本 YSP-4 Female YSP-4; P2: 父本 MIN-021 Male MIN-021; 1～3: F1 分離單株F1 segregation plants.

2.2 SRAP標記位點的偏分離分析

對PCR擴增得到的598個SRAP多態性標記位點，在P<0.05水平時，卡方檢驗發現不符合孟德爾分離規律的偏分離標記位點共有127個，其中母本連鎖群偏分離標記59個，偏分離標記比率為21.53%；父本連鎖群偏分離標記68個，偏分離標記比率為20.99%(表2)。這符合植物遺傳作圖偏分離標記比率小于30%的要求[19]，可用于構建四倍體雜交馬鈴薯遺傳連鎖圖譜。

2.3 遺傳圖譜的構建

利用Join Map 4.0作圖軟件，在選定LOD值為3.0～5.0條件下，構建出2張四倍體雜交馬鈴薯雙親的SRAP分子遺傳連鎖圖譜(圖3，圖4和表3)。母本圖譜覆蓋基因組總長度為1572.2 cM，含274個標記位點，標記間的平均距離為5.74 cM，12個連鎖群的長度范圍為14.03～214.44 cM，母本連鎖群1標記數目最多(62個)，母本連鎖群11標記數目最少(2個)；父本圖譜覆蓋基因組總長度為1932.23 cM，含324個標記位點，標記間的平均距離為5.96 cM，12個連鎖群長度范圍為93.65～242.06 cM，父本連鎖群5標記數目最多(55個)，父本連鎖群8標記數目最少(9個)。

表1 SRAP適宜引物及對供試材料多態性擴增結果Table 1 The sequences and the results of polymorphism amplification of SRAP primers

圖2 SRAP引物對部分供試材料的PCR擴增Fig.2 PCR amplification result of partial test materials by SRAP primers M: 100 bp Marker; 1～53: F1代部分單株Partial F1 individuals; A: 引物Bm8Coe7 SRAP primer Bm8Coe7; B: 引物Bm9Be9 SRAP primer Bm9Be9.

連鎖群Linkage group(LG)母本連鎖群 Maternal linkage group偏分離標記數Number of biased markers多態性標記數Number of polymorphic makers偏分離比率Ratio of distorted (%)父本連鎖群 Paternal linkage group偏分離標記數Number of biased markers多態性標記數Number of polymorphic makers偏分離比率Ratio of distorted (%)LG1136220.97124427.27LG293823.68145425.93LG311010.0033010.00LG4103627.782267.69LG562227.27165529.09LG621020.0031323.08LG71166.2552520.00LG8144729.792922.22LG92219.5241723.53LG1006021513.33LG1102011010.00LG121425.0042615.38合計Total5927421.536832420.99

圖3 四倍體雜交馬鈴薯母本(YSP-4)SRAP分子遺傳連鎖圖譜Fig.3 The female (YSP-4) molecular genetic linkage maps of tetraploid hybrid potato

3 討論

偏分離是生物進化的重要動力之一[20]。研究表明造成偏分離現象的因素較多，如基因組結構上發生突變、插入、缺失或重排[21]，非同源重組、基因轉化和轉座因子[22]，細胞質DNA的母性遺傳[23]，標記類型和群體類型[24]等。在植物遺傳作圖時標記偏分離現象普遍存在[25-26]，偏分離標記比率通常為6.8%～31.8%[27]。Bradshaw等[28]通過實驗證明，在遺傳作圖中偏分離標記與符合孟德爾分離規律的標記具有同等效果，若去除偏分離標記可能導致某些連鎖群上的標記失去連鎖關系。一般認為偏分離比率<30%的標記用于遺傳作圖不會影響圖譜的準確性[19]。本試驗得到的598個SRAP標記中有127個標記發生偏分離現象，在母本YSP-4和父本MIN-021各自的遺傳連鎖圖譜中，偏分離標記比率分別為21.53%和20.99%，均明顯低于30%，說明本試驗所建立的2張四倍體雜交馬鈴薯雙親的遺傳圖譜是準確的。

表3 四倍體雜交馬鈴薯雙親連鎖群的基本特征Table 3 The basic characteristics of parental linkage groups in tetraploid hybrid potato

對植物遺傳圖譜標記間平均距離的要求因研究用途不同而異。一般認為，用于基因定位的圖譜要求標記間平均距離為10～20 cM，用于QTL定位要求標記間平均距離<10 cM，用于基因圖位克隆要求標記間平均距離<1 cM[29-30]。本試驗構建的2張馬鈴薯親本圖譜中，母本YSP-4圖譜的標記間平均距離為5.74 cM，父本MIN-021圖譜的標記間平均距離為5.96 cM，均明顯小于10 cM。表明雙親的SRAP分子遺傳連鎖圖譜可用于馬鈴薯塊莖淀粉、干物質及產量等重要QTL和其相關基因的定位研究。另外，在雙親圖譜的12個不同連鎖群上，SRAP標記分布還不夠均勻且有較大空隙，這可能與試驗獲得的標記數目仍然偏少有關，需進一步篩選SRAP適宜引物，擴大作圖標記數目，進行雙親遺傳圖譜的加密研究。

4 結論

1)試驗篩選出36對SRAP適宜引物，對四倍體馬鈴薯“YSP-4×MIN-021”的雜種F1代182個分離單株及其雙親的基因組DNA進行擴增，獲得了598個SRAP分子標記。

2)構建了2張四倍體雜交馬鈴薯雙親的SRAP分子遺傳連鎖圖譜。母本YSP-4圖譜含274個SRAP分子標記，標記間平均距離為5.74 cM，12個連鎖群總長度為1572.2 cM；父本MIN-021圖譜含324個標記，標記間平均距離為5.96 cM，12個連鎖群總長度為1932.23 cM。