啤酒花不同外植體篩選及再生體系構建

楊軻，陳一酉，汪軍成，姚立蓉，孟亞雄，馬小樂，李葆春，司二靜，王化俊*

(1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

啤酒花(Humuluslupulus)為桑科葎草屬多年蔓性草本植物，在我國主要于新疆、內蒙古、甘肅、山東等地栽培[1-2]，既為食品加工原料，又為藥用植物，具有極高生產價值，但對栽培技術要求高、生產難度大、生長周期長。啤酒花作為啤酒的主要生產原料，其雌性花序所含α-酸賦予了啤酒獨特的香味和苦味，同時能提高啤酒的抑菌防腐和泡沫穩定性[3-4]。啤酒花對多種類型的病原微生物均較敏感，易受病毒侵害，啤酒花潛隱病毒(hop latent virus，HplV)和啤酒花潛隱類病毒(hop latent viroid，HpLVd)為兩大主要病害[5]，嚴重影響啤酒花品質及產量，尤其會降低啤酒花α-酸含量。因此，利用基因工程技術培育抗病毒、穩產、高質量的優質啤酒花品種對其產業發展具有重要意義。

構建穩定、高效的植物再生體系是利用基因工程進行育種改良的基礎。國內外對啤酒花再生體系研究報道較少。Skof等[6]使用不定芽再生能力不同的啤酒花品種，對外植體的選擇和再生培養基進行優化。宗凱利等[7]在國內首次建立了以節間外植體為供試材料的兩個啤酒花主栽品種‘麒麟豐祿’和‘青島大花’再生體系。許慧敏等[8]對‘于勒比特’啤酒花選用不同外植體、不同外源激素及不同培養基進行了愈傷組織培養。但啤酒花再生依然存在效率低、周期長、穩定性差的問題，阻礙了基因工程技術改良啤酒花性狀的發展。

不同外植體的選擇對植株再生體系的構建至關重要。Trojak-Goluch等[9]研究發現不同外植體類型和植物生長調節劑對植株再生率有影響。采用菊苣(Cichoriumintybus)子葉為外植體，出愈率顯著提高，達到93.31%[10]。張旭紅等[11]以歐洲百合(Liliummartagon)無菌苗鱗片為外植體，探究了不同濃度TDZ(噻苯隆，thidiazuron)分別與NAA(萘乙酸，1-naphthaleneacetic acid)和PIC(毒莠定，picloram)組合使用對胚性愈傷組織誘導的影響，確定了最適再生培養條件。以鱷嘴花(Clinacanthusnutans)幼嫩莖段為外植體，成功提高了鱷嘴花繁育系數，建立了完整高效的離體快繁技術體系[12]。柳福智等[13]以甘草(Glycyrrhizauralensis)無菌苗的下胚軸為材料，分析了不同濃度無機鹽及不同成分間的交互作用對甘草愈傷組織增長量的影響。葉興國等[14]研究發現植物組織培養存在很強基因特異性，明確植物離體培養性狀的調控及遺傳機制，有助于提高植株再生率。相關研究表明，啤酒花不同外植體類型對其植株再生頻率也有重要影響，不同生長素濃度及碳源處理下啤酒花試管苗生根移栽成活率差異明顯[15-16]。目前，啤酒花再生體系外植體的研究多選擇節間和葉盤，而以腋芽為主要外植體進行愈傷組織誘導、構建啤酒花再生體系的研究鮮有報道。

因此，本研究以不同基因型啤酒花種質進行外植體篩選和再生體系的構建，通過激素誘導扦插枝條生根[17]，獲得生根率最佳的種質材料；以啤酒花葉片、腋芽和根尖為外植體材料進行離體培養，設置不同激素配比組合，以期篩選出最適啤酒花外植體供體材料并建立高效穩定再生體系,為啤酒花種質保存，離體快繁及基因工程改良操作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

根據楊軻等[18]篩選的50份啤酒花核心種質的綜合聚類分析，從中獲得性狀優異的5份不同基因型種質PJ043、PJ267、PJ028、PJ105、PJ274，于2017年開花前取長度為15 cm左右半木質化枝條用于扦插生根，組織培養及快繁再生體系構建的原始材料。

1.2 優質外植體篩選

1.2.1啤酒花扦插枝條誘導生根 針對上述5份材料，分別剪取15 cm左右半木質化、生長健壯的中部枝條各40株，保留2～3葉。用0.2% KMnO4溶液浸泡枝條根部30 min 進行殺菌消毒，然后將枝條置于1000 mg·kg-1的乙哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)中浸泡15～20 s，扦插到水中，在20～25 ℃、弱光(1000～2000 lx)培養室誘導生根，培養10 d后觀察、統計生根率。

1.2.2啤酒花扦插枝條發芽 將1.2.1中生根良好的枝條，轉入含有微量元素[FeSO4·7H2O 26 μg·L-1、EDTA-2Na 28 μg·L-1、H3BO33.2 μg·L-1、MnSO4·4H2O 1.8 μg·L-1、ZnSO4·7H2O 0.22 μg·L-1、CuSO4·5H2O 0.08 μg·L-1、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02 μg·L-1]和大量元素(表1)的5種不同培養液中培養30 d，每5 d更換一次培養液，定期觀察啤酒花扦插枝條的生長狀況，以蒸餾水培養作為對照，30 d后觀察枝條發芽情況。

表1 營養液大量元素組成Table 1 The composition of mineral elements in nutrient solution (mg·L-1)

注：A1為霍格蘭營養液配方; A2為日本園試配方; A3～A5為自制營養液。

Note: A1is Hoagland nutritional formula; A2is Japanese garden test formula; A3-A5are homemade nutrient formula.

根據1.2.1和1.2.2實驗結果，選擇扦插枝條誘導生根和發芽最優異的啤酒花材料用于再生體系構建的外植體供體，分別截取啤酒花根尖、葉片、帶腋芽的莖段作為外植體材料。

1.3 外植體愈傷組織誘導

1.3.1外植體的處理 將外植體分別用75%的酒精浸泡30 s后，無菌水沖洗3次，然后加入15% H2O2滅菌25 min后，用無菌水沖洗3次。葉片切成0.5 cm2塊狀，腋芽與根尖切成0.5 cm的小段。

1.3.2愈傷組織誘導激素配比篩選 將1.3.1切取的外植體接種于基礎培養基[MS培養基+2 g·L-1PVP(聚乙烯吡咯烷酮，polyvinylpyrrolidone)+0.002 g·L-1谷氨酰胺]上，并添加不同濃度的6-BA(6-芐氨基嘌呤，6-benzylaminopurine)和IAA(吲哚乙酸，indole-3-acetic acid)進行愈傷組織誘導。激素組合模式為B1：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.05 mg·L-1；B2：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.10 mg·L-1；B3：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.20 mg·L-1；B4：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 0.10 mg·L-1；B5：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 0.20 mg·L-1；B6：6-BA 0.10 mg·L-1+IAA 0.20 mg·L-1。每皿接種15個外植體，3次重復，25 ℃弱光條件下培養，定期觀察，30 d后統計愈傷組織誘導情況，篩選最佳外植體材料。

1.3.3腋芽愈傷組織激素配比優化 為了提高啤酒花腋芽愈傷組織的誘導率，在試驗得出最適激素濃度配比基礎上，對該培養體系的激素濃度進一步優化，設置不同的激素類型及濃度配比進行腋芽愈傷組織誘導培養，篩選最佳激素組合。激素調控模式為C1：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C2：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C3：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C4：6-BA 0.10 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C5：6-BA 0.10 mg·L-1+IAA 2.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C6：2,4-D 0.3 mg·L-1。每皿接種15個愈傷，3次重復，培養條件同1.3.2。

1.3.4腋芽愈傷組織可溶性糖、可溶性蛋白含量測定 參照施海濤[19]的方法，測定各處理腋芽愈傷組織中可溶性糖、可溶性蛋白含量。

1.3.5不定芽的誘導 將1.3.3篩選到的最適培養基獲得的愈傷組織切成5 mm左右的小塊，在基礎培養基上繼代培養1～2代，然后將愈傷組織繼續切割成5 mm左右的小塊，轉接到不定芽分化基礎培養基(MS培養基+20 g·L-1葡萄糖+2 g·L-1PVP+0.002 g·L-1谷氨酰胺+0.1 g·L-1肌醇)上，同時添加不同激素配比(D1：0.01 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA；D2：0.05 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA；D3：0.05 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA；D4：0.10 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA；D5：1.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA；D6：1.50 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA)進行不定芽的誘導，每皿接種15個愈傷，3次重復，培養條件同1.3.2，15 d后統計愈傷不定芽的分化情況。

1.3.6生根培養與煉苗 不定芽高度達到2～3 cm時，將其轉接到生根基礎培養基(MS培養基+20 g·L-1葡萄糖+2 g·L-1PVP+0.002 g·L-1谷氨酰胺+2 g·L-1水解酪蛋白+0.1 g·L-1肌醇)上培養，同時添加不同6-BA和IBA激素組合(E1：0.1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA；E2：0.1 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1IBA；E3：0.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA；E4：0.2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA；E5：0.2 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1IBA；E6：0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA)。每皿接種15個不定芽，3次重復，培養條件同1.3.2。15 d后統計不定芽生根的分化情況。

待根系長至3 cm左右時，解開封口膜，在室內煉苗3 d后，洗去根系附著的瓊脂，移栽到裝有營養土、蛭石(體積1∶1)的花盆中，20 ℃弱光條件下保溫保濕培養7 d左右，待有新葉芽露出后，轉至室外，定期澆灌、管理。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，用Duncan多重比較法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 啤酒花扦插枝條誘導生根

圖1 不同啤酒花材料扦插枝條激素誘導生根率比較Fig.1 Comparison of hormone-induced rooting rate of cuttings from different hops不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。The different small letters mean significant differences at P<0.05, the same below.

在IBA誘導處理下，啤酒花種質PJ028、PJ043、PJ105、PJ267和PJ274生根率差異顯著(P<0.05)，依次為53.33%、72.00%、63.33%、81.67%和85.00%，種質PJ274扦插枝條生根率最高(圖1)。由此可確定PJ274為理想的啤酒花扦插枝條材料。

2.2 不同水培液對啤酒花扦插枝條發芽率及根系生長的影響

采用不同水培液對啤酒花PJ274進行扦插培養，測定發芽率并觀察啤酒花扦插枝條根系生長情況，各處理下根系均生長狀況良好，呈白色。由表2可知，水培處理下發芽率、生根數和根長均顯著高于蒸餾水對照(P<0.05)。水培2發芽率最高，為40%，水培3發芽率最低，為15%；水培2平均生根數最高，為72條，水培1、4和5次之，水培3最低，生根數僅為36條；水培1平均根長8.92 cm，為水培體系中最高，水培2次之。從這些數據可以確定，水培2作為處理對啤酒花進行扦插培養，生長狀況良好且發芽率高(圖2A)。

表2 不同培養體系對啤酒花生長的影響Table 2 The analysis of different nutrient solutions on the growth of hops

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，下同。

Note: The different small letters within the same column indicate significant differences at the 0.05 level. The same below.

2.3 不同激素配比對不同外植體愈傷組織誘導的影響

2.3.1篩選最佳外植體進行愈傷組織誘導 以啤酒花PJ274在水培2中獲得的扦插枝條為材料，葉片切成0.5 cm2塊狀，腋芽與根尖切成0.5 cm的小段，滅菌處理后分別置于添加不同6-BA和IAA激素組合的基礎培養基上，誘導愈傷組織。3種外植體均能成功誘導愈傷組織形成(表3)，B4無法誘導腋芽和根尖愈傷組織形成，B2是最佳激素組合，并與其他激素差異顯著(P<0.05)，腋芽誘導率最高，為51.11%，愈傷組織生長致密(圖2B)。

2.3.2誘導腋芽愈傷組織不同激素配比優化 為了提高啤酒花腋芽愈傷組織的誘導率，在2.3.1試驗得出最適激素濃度配比基礎上，對該培養體系的激素濃度進一步優化，設置不同的激素類型及濃度配比，篩選誘導腋芽愈傷組織的最佳激素組合。結果表明，激素配比濃度影響愈傷組織的生長，2,4-D對啤酒花腋芽愈傷組織無誘導作用。不同激素模式下愈傷組織誘導率差異顯著(P<0.05)，激素組別C3和C6均未能成功誘導出愈傷組織，誘導啤酒花腋芽愈傷組織形成的最佳激素調控模式為C4，誘導率高達86.67%(表4)，不定芽呈嫩綠色且生長狀況良好(圖2C)，各處理誘導出的愈傷組織中可溶性糖和可溶性蛋白含量隨著誘導率的提高而增加，其中激素組別C4處理下愈傷組織中的可溶性糖(圖3A)和可溶性蛋白含量(圖3B)顯著高于其他激素組別。

表3 不同激素組合對啤酒花愈傷組織誘導的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on callus induction by hops axillary buds

2.4 不同激素配比對啤酒花腋芽愈傷不定芽分化的影響

綜合2.2與2.3結果可知，腋芽為最佳外植體材料。進一步用不同激素配比對啤酒花腋芽愈傷組織進行分化培養獲得不定芽。由表5可得，在6組不同的激素配比中，第3組不定芽分化率最低，為15.56%；第5組啤酒花腋芽愈傷組織的不定芽分化率最高，為66.67%，顯著高于其他組(P<0.05)。因此，最適誘導腋芽愈傷組織分化不定芽的激素配比為D5(表 5和圖2D)。

圖2 啤酒花再生體系構建過程Fig.2 Construction process of hops regeneration system A: 水培啤酒花植株Hops seedling under hydroponic culture; B: 腋芽愈傷組織The callus of axillary buds; C: 腋芽愈傷組織繼代The subculture of the callus of axillary buds; D: 芽的分化Differentiation of the bud of hops; E: 根的分化Differentiation of the root of hops; F: 再生植株的移栽Transplantation of regenerated plants.

圖3 不同激素組合誘導的啤酒花腋芽愈傷組織可溶性糖和可溶性蛋白含量比較Fig.3 Comparison of soluble sugar and soluble protein contents in axillary bud callus of hop induced by different hormone combinations

激素濃度Hormone concentration 平均出愈數Number of callus induced誘導率 Induction rate (%)C13.67±0.3324.44±2.22cC28.67±0.8857.78±5.88bC30.000.00cC43.85±0.5886.67±3.85aC52.33±0.6715.56±4.44cC60.000.00c

表5 不同激素組合對啤酒花腋芽愈傷組織芽分化的影響Table 5 Effects of different hormone combinations on bud differentiation of axillary bud callus of hops

2.5 不同激素調控對啤酒花生根的影響

設置不同的外源激素組合，對分化出不定芽的愈傷組織進行生根誘導。由表6所示，各激素配比處理均能分化出根，但不同處理間差異顯著(P<0.05)，其中啤酒花腋芽愈傷組織根分化的最佳激素組合為E2(圖2E)，生根率高達66.67%。

2.6 試管苗移栽煉苗

對啤酒花試管苗進行室內煉苗3 d后，移栽到裝有營養土和蛭石(體積1∶1)的花盆中，20 ℃溫室弱光保溫保濕培養7 d，待有新葉芽展露后，轉至室外進行培養，試管苗移栽成活率可達80%，植株嫩綠，生長旺盛(圖2F)。

表6 不同激素組合對啤酒花腋芽愈傷組織根分化的影響Table 6 Effects of different hormone combinations on root differentiation of hop axillary bud callus

通過外植體選擇、愈傷組織誘導、不定芽分化、生根、煉苗和移栽等步驟，最終構建了啤酒花高頻穩定的再生體系(圖2)。

3 討論

開展植物再生體系的構建，外植體母體的獲取是第一步。近年對啤酒花再生體系的報道中，均未涉及啤酒花外植體母體培養的研究，啤酒花主要栽培模式也基本為土培枝條扦插模式[7-8]。水培作為無土栽培中最廣泛應用的方式之一，主要特點是以營養液替代土壤提供植物所需養分對植物進行培植，目前世界范圍內用水培模式進行作物生產的比重顯著提高[20-22]。Barone等[23]采用水培體系研究番茄(Solanumlycopersicum)和兩種微藻在霍格蘭營養液中共培養的相互作用，最終證實含有生物刺激素的水培體系對番茄植株的生長有促進作用。本研究采用水培模式，設置5種不同配比水培液，進行啤酒花外植體材料的母體培養。結果發現水培處理下，枝條扦插生根發芽效率顯著提高，水培營養成分不同，枝條扦插生根長芽差異顯著，尤其在大量元素Ca(NO3)·4H2O 945 mg·L-1，KNO3809 mg·L-1，MgSO4·7H2O 493 mg·L-1和NH4H2PO4153 mg·L-1水培模式下，扦插枝條最大平均生根數可達72條，最高發芽率為40%，根長為7.02～8.92 cm。因此，選用適宜的水培模式是進行啤酒花扦插枝條快速生根發芽的有效途徑，與傳統土培相比，便于取材管理，節省人力物力，提高效率。

本研究以啤酒花扦插生根發芽的枝條為外植體供體，分離其根尖、葉片、腋芽為外植體進行組織培養，通過比較出愈率和愈傷組織的生長狀態，發現帶腋芽的莖段愈傷誘導率高達86.67%，該值與菊苣(Cichoriumintybus)腋芽為外植體愈傷組織誘導率33.3%～62.5%相比有明顯提高[10]，也優于紅寶石球花報春(Primuladenticulata)以腋芽為外植體的組織誘導率73.33%[24]。可溶性糖和可溶性蛋白作為植物組織生長發育的重要能量供體和營養物質，是評價植物組織生長狀態的重要因素[25]。本研究對腋芽為外植體，誘導的愈傷組織中營養物質可溶性糖和可溶性蛋白含量測定結果表明，愈傷組織誘導率越高，活性越強，其組織中可溶性糖和可溶性蛋白含量也最高，這與閆永慶等[26]對西伯利亞白刺(Nitrariasibirica)愈傷組織的耐鹽性分析的結果相似。因此，可以確定腋芽是啤酒花再生體系構建的適宜外植體。

不同激素配比對植物細胞分化和生長方向均有影響，對植物形態建成發育有引導作用[27]。6-BA配合IAA能夠在啤酒花莖段基部誘導出愈傷組織，但芽誘導率低；IBA配合6-BA能使芽誘導率及增殖倍數提高[28]。許慧敏等[8]發現激素濃度為6-BA 0.5 mg·L-1+IAA 1.5 mg·L-1時啤酒花腋芽的愈傷組織誘導率為69.2%。本研究中，6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1的激素配比能夠成功誘導啤酒花葉片、根尖和腋芽產生愈傷組織，出愈率依次為46.67%、48.89%和51.11%。而進一步優化腋芽愈傷組織誘導激素配比，在含有激素6-BA和IAA 的基礎上，添加適量2,4-D，發現6-BA 0.1 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2 mg·L-1的激素組合為啤酒花腋芽外植體最佳激素配比，誘導率高達86.67%，進一步說明本研究中啤酒花腋芽愈傷組織誘導激素組合更具優勢。He等[29]以不同濃度6-BA和NAA處理黃柏(Phellodendronchinense)幼苗，結果表明外源激素的濃度高低對黃柏幼苗生長狀況有重要調控作用。在本研究中優選出的6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1激素調控組合下，啤酒花最佳愈傷組織不定芽分化率為66.67%，而許慧敏等[8]激素配比為IAA 0.25 mg·L-1+TDZ 2.0 mg·L-1的MS-B5培養基上不定芽誘導率僅為56%，不定芽的誘導率顯著提高，為進一步誘導生根創造了良好條件。

4 結論

本研究通過對啤酒花再生體系過程中所需外植體來源、激素配比、培養條件、移栽處理等方面的探索和優化。獲得材料PJ274在水培處理下生根發芽能力強，為組織培養外植體最優來源母體，腋芽為最適外植體，在適宜的激素配比處理下，腋芽愈傷組織誘導率達到87.5%，芽的分化率為66.67%，生根率為66.67%，試管苗移栽成活率達到80%，植株生長健壯，最終成功建立了以腋芽為外植體的高頻啤酒花再生體系。