AGR2對低氧微環境下A549細胞遷移和侵襲的影響

閻巖 陸盺冶 宋楠南 董芳 茅安 陸中元

近年來研究表明，低氧微環境可通過多種途徑促進非小細胞肺癌細胞的侵襲和轉移，是決定惡性腫瘤預后的重要因素之一。低氧可引起腫瘤細胞中低氧誘導因子（HIFs）家族成員表達升高及活性增強，進而上調其下游基因的表達，促進腫瘤細胞的生長及侵襲［1-3］。既往研究發現，低氧可通過HIFs家族中的低氧誘導因子1（HIF-1）上調膠質母細胞瘤及乳腺癌等多種癌細胞中前梯度蛋白2（AGR2）的表達。AGR2在包括食管癌、胰腺癌、前列腺癌及乳腺癌在內的多種人類腺細胞癌中均表達升高。大量體內及體外研究證實，AGR2在促進癌細胞生長、侵襲、轉移及耐藥等方面均發揮重要作用［4-5］。2018年8月至10月作者通過實驗研究，探討AGR2對低氧環境下A549細胞遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞的培養和處理 A549培養于含有10%胎牛血清的F-12K培養基中，常規培養條件為37℃，5%CO2，20% O2。當細胞培養至融合90%后，用0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有試驗均采用對數生長期細胞。當細胞生長融合至約50%，采用Lipofectamine 2000轉染試劑盒（Invitrogen公司）將終濃度為50 nmol/L的人AGR2特異性小干擾RNA（siAGR2）或其陰性對照序列（siScramble）轉入A549細胞。轉染24h后，將細胞在無血清培養基中饑餓過夜，然后轉入三氣培養箱（1% O2）中培養24h。

1.2 蛋白質免疫印跡（Western Blot） 將6孔板中的A549細胞用PBS洗滌3次，然后加入含有1mmol/L蛋白酶抑制劑的SDS裂解液充分裂解細胞。4℃ 12000r/min條件下離心10min后收集上清液。采用BCA法測定收集上清液濃度，并據此配平各樣品，以保證每孔上樣30μg蛋白樣品。SDS-PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜，并用5%脫脂奶粉室溫封閉1h。分別采用AGR2抗體（Abcam公司）和β-actin抗體（Proteintech公司）孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次后，在室溫下孵育二抗1 h。采用ECL化學發光法進行檢測。

1.3 熒光實時定量PCR 處理后的A549細胞用PBS洗滌3次，每孔中加入1ml TRIzol提取總RNA，檢測RNA樣品在A260與A280處的吸光度值，計算RNA濃度。按Primescript RT逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司）步驟行逆轉錄合成cDNA。根據SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa公司）說明書配制20μl反應體系進行qRT-PCR反應，每個樣本設3復孔。實驗所用的引物序列：AGR2上游引物：5'-ACAAAGGACTCTCGACCCAAA-3'， 下 游 引 物 ：5'-GTGGGCACTCATCCAAGTGA-3'； GAPDH（內參照基因）上游引物：5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，下游引物：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。

1.4 Transwell實驗 在Transwell上室中加入濃度為 0.2μg/μl的 Matrigel，然后 37℃下孵育 30min使Matrigel 聚合成凝膠。將各組細胞用無血清DMEM培養基制成單細胞懸液，調整細胞密度至5×105/ml，每個小室中加入細胞懸液200μl，每組重復3孔。Transwell 下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，每孔600μl，然后低氧培養24h。擦去上室凝膠后4%多聚甲醛固定15min。室溫晾干小室后采用結晶紫染色20min。200倍顯微鏡下計數中間及四周5個視野細胞數，計算平均值。

1.5 平板劃線實驗 取6孔板中培養的A549細胞，當細胞生長至80%融合，用200μl無菌移液器槍頭在培養板底中央做出劃痕。然后用PBS緩沖液洗滌3次以洗脫劃下的細胞殘渣，用記號筆在板底劃線處做記號等分劃痕后，在倒置顯微鏡下拍照起始劃痕狀態（0h）。低氧環境下培養24h后，拍照、計數遷移細胞數，每孔計數3個視野，每組3個復孔。以遷移至劃痕內的細胞個數作為A549遷移能力的定量指標。

1.6 生存分析 采用在線工具Kaplan-Meier Plotter對肺腺癌患者的生存期進行薈萃分析。進入在線工具后輸入AGR2，選擇總生存期（OS）和肺腺癌選項（n=720），即可計算中位生存期并繪制生存曲線。

1.7 統計學方法 采用SPSS19.0軟件及GraphPad Prism 6軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低氧誘導AGR2表達上調 分別采用RT-PCR和Western blot方法檢測常氧和低氧條件培養的A549細胞中AGR2 mRNA和蛋白的表達。結果顯示，低氧環境能夠明顯上調A549細胞中AGR2的表達，見圖1。

圖1 低氧可上調A549細胞系中AGR2的表達

2.2 siAGR2干擾效率的驗證 轉染AGR2特異性siRNA及對照siRNA于A549細胞48h后，分別采用RT-PCR和Western blot方法檢測AGR2 mRNA和蛋白的表達變化。與對照組（siScramble）比較，AGR2的mRNA及蛋白表達水平均顯著下調（P＜0.05），提示siRNA能夠有效抑制AGR2在A549細胞中的表達（見圖 2）。

2.3 干擾抑制AGR2對低氧環境下細胞侵襲能力的影響 A549細胞分別轉染siAGR2和siScramble，低氧培養24h后采用Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。與對照組（siScramble）比較，siAGR2組中穿越Matrigel屏障的浸潤細胞數明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示靶向沉默AGR2的表達能夠顯著抑制低氧環境下A549細胞的侵襲能力（見圖3）。

圖2 AGR2 siRNA能有效抑制a549細胞系中AGR2的表達

圖3 AGR2 siRNA 抑制缺氧誘導的A549細胞侵襲

2.4 干擾抑制AGR2對低氧環境下細胞遷移能力的影響 平板劃線實驗結果提示，與對照組比較，siAGR2組中遷移至劃痕內的細胞數顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示抑制AGR2的表達能夠顯著抑制低氧環境下A549細胞的遷移（見圖4）。

圖4 AGR2 siRNA 抑制缺氧誘導的A549細胞遷移

2.5 AGR2對肺腺癌患者生存期的影響 鑒于靶向沉默AGR2能夠明顯抑制低氧微環境對A549細胞侵襲、遷移的促進作用，根據AGR2的表達差異對肺腺癌患者的生存期進行薈萃分析。基于720例患者的臨床數據結果發現，高表達AGR2的肺腺癌患者中位生存期為81.1個月，顯著低于低表達組（110.27個月），見圖5。

圖5 AGR2對肺腺癌患者生存期的影響

3 討論

侵襲轉移是肺腺癌的基本生物學特性，也是導致其預后不良的根本原因。肺腺癌細胞的侵襲和轉移不僅與細胞本身侵襲能力增強、粘附能力下降有關，還與其所處的腫瘤微環境密切相關。闡明肺腺癌微環境影響其侵襲、遷移的作用及機制，對開發新的治療策略具有重要意義。

AGR2最早由Kuang等［6］在雌激素受體表達的人乳腺癌細胞株中被篩選發現。自被發現以來，大量證據證實AGR2 在多種人類腫瘤中表達升高，且與腫瘤的發生和轉移密切相關。研究發現，低氧微環境能夠通過HIF-1誘導乳腺癌、膠質瘤等惡性腫瘤細胞中AGR2表達上調，而AGR2能夠與胞內HIF-1蛋白結合，延緩其降解，在腫瘤增殖、血管生成及耐藥等方面發揮重要作用［7］。本資料發現，低氧培養能夠顯著上調肺腺癌細胞系A549中AGR2的表達，提示AGR2可能參與低氧微環境下肺腺癌細胞的生物學特性改變。

肺癌細胞的侵襲性生長和遠處轉移是導致肺癌患者預后不良的重要原因。近年來研究發現低氧微環境是促使癌細胞發生轉移的始動因素［8］。癌細胞的侵襲和遷徙是腫瘤轉移不可或缺的環節。大量研究證實低氧微環境可通過上調HIF家族表達、下調細胞間粘附分子以及促進新生血管形成等途徑促進肺癌細胞的侵襲、遷移［9-10］。Liu等［5］將轉染AGR2過表達載體的乳腺癌細胞接種于大鼠乳腺脂肪墊中，結果發現高表達AGR2的乳腺癌細胞轉移率界于77%～92%，而對照組大鼠無一例發生轉移，表明AGR2在惡性腫瘤轉移過程中發揮重要作用。Wang等［4］研究發現，食管腺癌細胞系SEG-1分泌的AGR2蛋白可顯著增強其自身的遷移能力，抑制其表達可明顯減小食管腺癌裸鼠成瘤體積。Ramachandra等發現AGR2在多數轉移性胰腺癌中表達明顯升高。下調AGR2后，胰腺癌細胞的生長被明顯抑制，同時其侵襲能力也顯著減弱［11］。本資料中，在低氧培養A549細胞的同時通過干擾RNA方法抑制AGR2的表達，結果發現下調AGR2能夠明顯抑制A549細胞的侵襲、遷移能力，提示AGR2在低氧引起的肺癌細胞侵襲性改變過程中發揮關鍵作用，沉默其表達可能會改善肺癌患者預后。既往研究也表明，AGR2蛋白在健康人群中的表達量較低，但在非小細胞肺癌患者中的表達顯著升高［12］。采用干擾RNA技術抑制AGR2基因可顯著減弱肺癌細胞的轉移能力［13］。另有研究報道稱，AGR2基因是一種與腫瘤轉移相關的基因，其在部分高轉移性腫瘤的循環腫瘤細胞中表達升高［14］。與上述研究結果一致，基于720例患者的臨床數據結果發現，高表達AGR2的肺腺癌患者的中位生存期顯著短于低表達組，提示AGR2可作為評估患者預后的標志物，且可作為治療肺腺癌的潛在靶點。

綜上所述，低氧微環境可誘導肺腺癌A549細胞系中AGR2的表達上調，靶向沉默AGR2可有效抑制低氧對腫瘤細胞侵襲、遷移能力的促進作用，有助于進一步認識低氧微環境與肺腺癌轉移的相關機制。