基于超高效液相色譜—飛行時間質譜聯用的冠心病非靶向代謝組學分析及代謝標記物的探索

劉倩倩，王春玥，宋晨曦，李一平，伏蕊，朱成剛，竇克非

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）是最常見的心血管疾病，但其確切的發病機制至今仍不明確[1-3]。在過去十年里，關于動物及人類代謝組學方面的研究均取得巨大進步，通過聯合使用靶向及非靶向的方法，代謝組學已經識別出多種不同心血管疾病相關的代謝物指標[4-6]。目前針對冠心病的靶向代謝組學研究開展較多，但能夠反映冠心病患者整體內環境的代謝標志物及發病機制為導向的非靶向代謝組學研究卻開展得十分有限。因此，本研究借助超高效液相色譜—飛行時間質譜聯用（ultra-high performance liquid chromatography coupled to quadruple time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF/MS）的非靶向代謝組學方法分析了嚴重冠狀動脈狹窄的冠心病患者和冠狀動脈造影正常者之間的血漿代謝物差異。

1 資料與方法

研究對象：本研究入選了2011年6月至2015年3月于中國醫學科學院阜外醫院接受擇期經皮冠狀動脈介入治療或冠狀動脈造影的住院患者300例，并分為兩組，即冠心病組（n=150），患者冠狀動脈嚴重狹窄（狹窄≥80%）；和年齡與性別 1：1 匹配的冠狀動脈造影正常（狹窄≤20%）的對照組（n=150）。并利用UHPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學方法，分析兩組患者血漿代謝圖譜并挖掘兩組間差異性最顯著的代謝物（圖1）。本研究經阜外醫院倫理委員會批準，入組患者及其家屬均簽署了知情同意書。

樣本采集和處理：造影前采集空腹靜脈血置于肝素抗凝管中，4℃ 2 300 rpm離心10 min后取上清，12 000 rpm離心15 min后取400 μl分裝至凍存管，-80℃條件下保存直至上機檢測。

UHPLC-QTOF/MS檢測：運用UHPLC-QTOF/MS的代謝組學檢測方法，并利用陽離子相和陰離子相兩種電離模式聯合檢測，對血清進行一級、二級離子檢測。色譜條件：序列中每隔8個檢測樣本插入一個空白樣本（75%乙腈溶液）和一個質量控制（QC）樣本，進樣量為4 μl。色譜柱為Waters ACQUITY UHPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1% 甲酸溶解于水（陽離子相）或0.5 mM氟化銨陰離子相）溶解于水；流動相B為0.1%甲酸溶解于乙腈溶液（陽離子相）或乙腈溶液（陰離子相）。質譜條件：質量掃描范圍：50～1 200 mz；掃描速率：4質譜/s。鞘氣溫度：400℃；干燥氣溫度：250℃；鞘氣流速：12 L/min；干燥氣流速：16 L/min；噴霧電壓：20 psi （陽離子模式）或40 psi（陰離子模式）；噴嘴電壓：0 V。

數據預處理與分析：首先使用ProteoWizard將質譜原始數據轉換為mzXML格式，然后使用 XCMS（xcms4dda、xcms4 lipid）程序對數據進行處理，并檢索自建庫并獲得矩陣數據表，矩陣數據表中包括質荷比（m/z）、保留時間（RT）、峰面積。使用CAMERA軟件對XCMS處理過的數據進行峰篩選，其后利用LOESS回歸模型對QC樣本進行歸一化處理，與 QC匹配度低于80%的數據被棄去。

圖1 臨床研究技術路線

統計學分析方法：所有數據應用 SAS 9.4 軟件進行分析。連續變量用均數±標準差表示，并用t檢驗進行比較。分類變量用頻數及百分比表示并以卡方檢驗進行比較。利用多元線性回歸模型，分析校正傳統冠心病危險因素和檢測批次等因素后冠心病組與對照組之間血漿顯著性差異代謝物小分子。利用Bonferroni校正，將顯著性差異的閾值設置為P＜8.2×10-5（0.05/611）以減少假陽性錯誤概率。利用Logistic 回歸模型分析代謝物與疾病發生風險的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

兩組患者臨床基線資料的比較（表1）：冠心病組和對照組患者的體重指數組間差異無統計學意義；相較對照組，冠心病組患者高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙及冠心病家族史比例均明顯更高（P均＜0.05）。

冠心病患者血漿代謝組學變化（圖2）：本研究對冠心病組和對照組之間的差異代謝物進行了多元線性回歸分析。

圖2 105個冠心病人群血漿差異小分子代謝物成分分類圖

在校正傳統冠心病危險因素（年齡、性別、體重指數、吸煙）和檢測批次后，共篩選出105個兩組間差異顯著的代謝物，其中包含84種已知代謝物和21種未知代謝物。組間顯著性差異代謝物主要包含51 種甘油磷脂類、10 種肉毒堿、8 種游離脂肪酸、5 種膽汁酸代謝產物、3 種氨基酸類以及7 種未統一分類代謝物，其中脂質代謝異常（甘油磷脂類、肉毒堿、游離脂肪酸）占總代謝狀態改變的65.74%，是總代謝狀態改變的主要原因，這驗證了既往研究所報道的脂質代謝異常在冠心病發病機制中的重要作用。

最具預測性的冠心病相關的血漿代謝物（表2）：經過多元線性回歸分析及Bonferroni校正后，從上述105種差異代謝物中篩選出5種差異最為顯著的血漿代謝物（P均＜0.05），即棕櫚酸、亞油酸、脂酰肉毒堿（14：1）、石膽酸、磷脂酰甘油（20：3/2：0）。校正危險因素后，Logistic 回歸模型分析結果顯示，這5種代謝物與冠心病發病風險顯著正相關（OR=2.791～7.237）。

表2 5種組間差異性最顯著的代謝物及其與冠心病患病風險的關聯

3 討論

本研究借助UHPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學方法分析了冠心病患者和冠狀動脈造影正常者之間血漿代謝物水平的差異。研究一共篩選出105個差異性代謝物，其中脂質代謝（磷脂、肉毒堿、游離脂肪酸）占總代謝狀態改變的65.74%，并從中篩選出5種差異最為顯著的血漿代謝物，其在冠心病組均顯著高于對照組，且與冠心病發病風險顯著正相關，OR值范圍從石膽酸的 2.791到棕櫚酸的7.237。

冠心病組患者血漿棕櫚酸水平顯著高于對照組，是冠心病相關性最高的代謝物之一，同時也是冠心病發病風險預測能力最高的代謝物（OR=7.237，95% CI：2.390～21.912，P=0.0001），這與既往多項研究結果一致[7-8]。近期一項臨床試驗Meta分析結果顯示，棕櫚酸（16：0）可以顯著增加總膽固醇及低密度脂蛋白（LDL）水平[9]。另外一項體外實驗也驗證了棕櫚酸可以通過觸發炎癥相關信號通路而引起內皮細胞功能紊亂，從而具有誘發動脈粥樣硬化形成的潛力[10]。

本研究中，亞油酸血漿水平每升高1個單位，冠心病的患病風險就增加6.133倍（95% CI：2.367～15.893，P=0.0005)。最近研究發現，作為日常生活中最常見的ω-6多不飽和脂肪酸的亞油酸攝入增加后會提高5年內全因死亡風險、心血管疾病包括冠心病的發病風險[11]，這與本研究結果也是一致的。至于亞油酸水平增加引起心血管發病的機制，有研究證實與氧化型油酸代謝物（oxidized linoleic acid metabolites，OXLAMs）的升高有關，而OXLAMs具有誘使巨噬細胞轉化為泡沫細胞及內皮細胞功能紊亂的作用導致動脈粥樣硬化形成[12-15]。

本研究也進一步驗證了磷脂酰甘油（20：3/2：0）與冠心病的強相關性。目前較少研究關注過磷脂酰甘油這一亞類的甘油磷脂，本研究首先報道了人血漿中磷脂酰甘油（20：3/2：0）水平與冠心病患病風險正相關的結果（OR=3.938，95% CI：1.891～8.204，P=0.0001）。早前有研究發現在動脈粥樣硬化大鼠模型的血漿中磷脂酰甘油類水平顯著升高[16]，這也間接驗證了本文的研究結果。

幾乎所有有關冠心病的代謝組學研究都報道過肉毒堿類代謝物在冠心病人群與對照人群中的差異，本研究中也發現了一種中鏈的脂酰肉毒堿（14：1）與冠心病患病風險顯著相關（OR=3.379，95%CI：1.913～5.967，P＜0.0001）。有研究發現血漿中肉毒堿水平的升高與巨噬細胞脂質代謝過程中β氧化功能不全有關，而巨噬細胞脂質超載向巨噬泡沫細胞轉化在動脈粥樣硬化的形成中起到至關重要的作用[17]。

目前關于石膽酸與血管病變的研究并不多，本研究首先發現血漿石膽酸水平的升高與冠心病患病風險呈正相關（OR=2.791，95% CI：1.74～4.477，P=0.0003）。Charach等[18]通過糞便代謝組學檢測發現冠心病患者排泄膽汁酸的能力下降，因此不能擺脫體內過高的脂質負荷，這也可以解釋本研究結果中冠心病患者血漿中石膽酸的堆積。多項研究發現瘀膽癥的患者體內石膽酸的堆積能夠引起肝組織炎癥反應，相關體外實驗顯示石膽酸能夠通過激活核因子-κB（NF-KB）和P38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）相關炎癥通路而誘導血管內皮細胞功能障礙[19]，間接提示石膽酸可能具有致動脈粥樣硬化的作用。

本研究局限性：本研究為單中心病例對照研究，雖然借助先進的代謝組學手段挖掘出許多代謝標志物與冠心病患病之間的關聯，但尚不能為其因果性提供依據，因此還需要在前瞻性隊列研究以及細胞及動物的相關干預實驗中進行驗證。

綜上所述，本研究借助UHPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學方法分析了嚴重冠狀動脈狹窄冠心病患者和冠狀動脈造影正常者之間血漿代謝物水平的差異。本研究不僅提供了更全面的冠心病血漿代謝圖譜改變，還首次挖掘出了石膽酸和磷脂酰甘油（20：3/2：0）這兩種與冠心病病理生理過程有強關聯的潛在生物標志物，為從整體水平探索冠心病動脈粥樣硬化病理生理機制及尋求新的治療途徑供了依據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突