褐煤發酵制生物氫過程中關鍵液相產物的變化規律

夏大平 黃 松 張懷文

1.河南理工大學能源科學與工程學院 2.河南理工大學瓦斯地質與瓦斯治理國家重點實驗室培育基地3.中原經濟區煤層（頁巖）氣協同創新中心

0 引言

在對新能源的探索中，氫能因其易燃、高效、熱值高等優點受到廣泛關注[1-3]，而生物制氫技術因為反應條件溫和且耗能少，被公認為是一種最有前途的方法[4-5]。生物質暗發酵產氫不僅可以處理有機廢物，同時可以獲得清潔能源，實現了廢棄物資源化利用[6-9]。

煤制生物氫技術是利用礦井水中的混合菌群對煤炭進行暗發酵產氫，較之于利用純菌種進行生物制氫，可減少菌種分離、DNA鑒定和擴大培養等一系列繁雜的技術和設備，在節約生產成本的同時，還提高了制氫工藝的可操作性，從技術層面更有利于工業化生產[10]。蘇現波等通過在實驗室模擬微生物發酵產氣的過程，證實了煤在適宜條件下可以被微生物降解轉化成H2和CH4[11]，同時微生物的活動能使煤的滲透性增強[12]，更有利于發酵液與發酵底物接觸。夏大平等[13-15]利用葡萄糖用量、pH值、煤的用量及Fe2+濃度對產氫進行正交優化，從而確定了煤發酵產氫條件。長期以來，對煤厭氧發酵產氫的研究主要致力于提高產氫效率上，而對煤發酵產氫過程中液相中間產物內有機物的變化及相互轉化關系卻鮮有研究，而液相產物的種類和濃度不僅關系到煤轉化成生物氫的效率，還是研究煤制生物氫生成機理的重要組成部分。

有學者[16-18]對發酵底物進行研究，發現中低階煤由于其生物可利用性較強，在發酵產氫或產甲烷過程均效果顯著。鑒于此，筆者采用陜西省大柳塔褐煤作為發酵底物，在實驗室條件下模擬發酵產氫實驗。運用氣質聯用儀（GC-MS）測試煤發酵產氫過程第1、3、6、9天的液相中間產物，以期為認識產氫過程液相有機物的變化和相互轉化規律提供一定的實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 煤樣及菌種來源

煤樣取自大柳塔褐煤，采樣時取煤層開采處新鮮煤樣。實驗前將煤樣破碎，篩選60～80目的粒度，滅菌處理后在真空干燥箱內80 ℃干燥24 h，放入干燥器內密封保存備用。取部分煤樣進行工業分析測試，煤樣的工業分析參照標準DL/T 1030-2006，其結果為：Mad=7.86%；Aad=10.90%；Vdaf=41.30%。菌種源自河南焦煤能源有限公司古漢山礦深層礦井水，取回后置于4 ℃實驗室冰箱內密封保存備用。

1.1.2 培養基的制備

實驗所用培養基是依據本文參考文獻[19—21]所述產氫培養基，結合自身煤富集和厭氧產氫發酵過程，進行優選后確定的增產培養基。

產氫培養基組成（以1 000 mL為例）：NH4Cl，1.0 g；MgCl2·6H2O，0.1 g；K2HPO4·3H2O，0.4 g；NaCl，2.0 g；NaHCO3，2.0 g；胰化酪蛋白，1.0 g；酵母膏，1.0 g；葡萄糖，10.0 g；乙二胺四乙酸二鈉，2.0 g；微量元素液，10 mL；復合維生素溶液，10 mL。

其中微量元素液組成：氨基三乙酸，1.50 g；MnSO4·2H2O，0.50 g；MgSO4·7H2O，3.00 g；FeSO4·7H2O，0.10 g；NaCl，1.00 g；CoCl2·6H2O，0.10 g；CaCl2·2H2O，0.10 g；CuSO4·5H2O，0.01 g；ZnSO4·7H2O，0.10 g；H3BO3，0.01 g；KAl (SO4)2，0.01 g；NiCl·6H2O，0.02 g；NaMoO4，0.01 g；蒸餾水 1 000 mL。

復合維生素溶液組成：生物素，2 mg；葉酸，2 mg；B6，10 mg；B2，5 mg；B1，5 mg；煙 酸，5 mg；泛酸鈣，5 mg；B12，0.1 g；對氨基苯甲酸，5 mg；硫辛酸，5 mg；蒸餾水，1 000 mL。

將以上培養基加入到1 000 mL錐形瓶中，用10%的NaOH溶液調節pH值至7.0，再經高溫滅菌鍋滅菌后，加入0.5 g L-半胱氨酸鹽酸鹽及1 000 mL古漢山礦礦井水。充分混合并搖勻，充入氮氣，制造無氧環境，密封，制備成產氫菌液。

1.1.3 實驗儀器

實驗儀器包括：粉碎機、電子天平、HVE-50高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）、氮氣瓶、干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養箱、馬福爐、高速離心機、減壓蒸餾裝置、氣相色譜—質譜聯用儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 煤厭氧發酵產氫實驗

將1 000 mL密封好的產氫菌液放入35 ℃恒溫培養箱，富集4 d菌種，之后將產氫菌液平均分裝在5個250 mL的錐形瓶內，并將20 g處理好的原煤加入錐形瓶中，充入氮氣密封，在無菌厭氧環境下連接產氣模擬裝置（圖1），連接完成后再次放入35 ℃恒溫培養箱中培養，當無明顯產氣發生后結束產氫過程。在產氫過程中每隔1 d輕晃一次產氣瓶，以保證產氫過程的高效進行。煤厭氧發酵產氫的氣相產物每日測試1回。考慮到單日液相中間產物的變化不是很明顯，所以分別在第1、3、6、9天取樣測試。

1.2.2 萃取實驗

將200 mL生物產氫發酵液平均分裝在4支離心管中離心，離心結束后過濾發酵液，將濾液加入到125 mL的分液漏斗中，加入HCl，使pH值小于2。稱取10 g NaCl（在馬福爐550 ℃干燥4 h，放置干燥箱中備用）加入到分液漏斗中，攪拌使其充分溶解。吸取10 mL二氯甲烷加入到分液漏斗中，在常溫下萃取10 min，然后收集分液漏斗下層有機相，重復上述操作2次，合并3次的萃取液，然后氮吹濃縮至干，加入2 mL二氯甲烷（CH2Cl2）溶解，過無水Na2SO4小柱干燥，供GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS實驗

GC-MS由安捷倫7890A型氣相色譜儀與5795C質譜儀組成，色譜柱為VF-WAXms（30 m×250 μm×0.25 μm），采用程序升溫：起始溫度80 ℃（保持5 min）后以3 ℃/min升溫至200 ℃，再以2 ℃/min升至300 ℃（保持10 min），汽化室溫度300 ℃。質譜參數電子能量70 eV、離子源溫度230 ℃、接口溫度230 ℃，檢測方式：全掃描方式，質量范圍40～500 amu（amu為atomic mass unit的縮寫，表示原子質量單位）。

小分子揮發性脂肪酸也采用安捷倫7890A型氣相色譜儀進行檢測，利用TCD檢測器并配備Agilent CarbonPlot型色譜柱。利用氣相色譜柱對注入液體進行分離，載氣攜帶待測液體進入氫火焰離子化檢測器的噴嘴口，并在色譜儀的含氧空氣中灼燒，然后依次電離為正負離子，在離子室內形成的離子流被收集后，放大為電信號并經記錄儀記錄，微機處理，與標準進行比較，得出樣品中各種組分的濃度。

2 結果和分析

2.1 產氫結果

大柳塔褐煤厭氧發酵產氫的單日產氫量、累計產氫量以及氫氣濃度如圖2所示，單日產氫量分別在第4天和第7天達到產氣高峰，累計產氫量最終達到78 mL，氫氣的最終產率為3.9 mL/g。氫氣濃度呈現與產氣量相近的變化趨勢，在第6天濃度達到17.8%的峰值，當產氣結束后，氫氣濃度降至7%。

2.2 液相產物分析結果

分別對大柳塔褐煤厭氧發酵第1、3、6、9天的發酵液進行萃取和GC-MS測試，試驗結果見圖3。

圖3-a為第1天煤厭氧發酵產氫液相產物GC-MS測試結果，所測出的成分主要包括芳香小分子酸類（苯乙酸，苯丙酸），酚類（對甲基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚），脂肪酸類（棕櫚酸），芥酸酰胺和2-吲哚酮以及一些復雜的化學物質[Cyclo(leucylprolyl)和鄰苯二甲酸二異辛酯等]。

圖3-b為第3天煤厭氧發酵產氫液相產物GC-MS測試結果，檢測到的化學物質主要包括芳香小分子酸類（苯甲酸、苯乙酸、苯丙酸）、酚類（對甲基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚）、脂類（鄰苯二甲酸二異丁酯），正構烷烴（從正二十一烷到正三十三烷）、大分子酸以及一些化學結構復雜的物質[1,3-惡唑和Cyclo(leucylprolyl) 等 ]。

圖3-c為第6天煤厭氧發酵產氫液相產物GC-MS測試結果，所檢測出的化學物質包含芳香小分子酸類（苯甲酸、苯乙酸、苯丙酸）、酚類（對甲基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚）、脂肪酸類（辛酸，棕櫚酸），烷烴，油脂，酰胺（芥酸酰胺，戊內酰胺）、酮類以及一些結構復雜的化學物質[Cyclo(leucylprolyl)和鄰苯二甲酸二異辛酯等]。

圖3 -d為第9天煤厭氧發酵產氫液相產物GC-MS測試結果，所檢測出的化學物質包含芳香小分子酸類（苯乙酸、3-苯丙酸）、酚類（對甲基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚）、脂肪酸類（辛酸、棕櫚酸）、烷烴、酰胺（戊內酰胺、芥酸酰胺）、酮類以及一些結構復雜的物質（桔利酮、2,6,10,15-四甲基十七烷等）。

對以上4組GC-MS測試圖的物質含量進行分析（表1），當物質含量較低，幾乎可以忽略時，用特殊符號※標記。由表1可以看出，對甲基苯酚、苯乙酸、苯丙酸和芥酸酰胺在第1～3天時百分含量降低。原因在于煤發酵產氫初期發生水解作用，通過水解發酵細菌和產氫產乙酸菌等多種厭氧菌分泌胞外酶，催化復雜有機質水解成乙酸、CO2、長鏈脂肪酸、甘油、NH4+等小分子物質，導致百分含量的降低。在第3～6天時，煤中可利用的小分子化合物較少，大分子化合物開始被微生物分解，百分含量出現大幅增長。但隨著液相中的物質不斷的被利用，煤中有機質的分解速度降低，所以在第6～9天時百分含量又有所降低。

根據氣相色譜儀檢測出的結果和標準進行對比得出的小分子揮發性脂肪酸的物質累積量（表2），其中甲酸、乙酸、丙酸均呈現逐漸積累的趨勢，而丁酸例外，丁酸在產氫末期部分被利用，導致其含量減少。其中，乙酸的物質累積量最大，為0.29 mmol/L，其次是丁酸、丙酸，甲酸的物質累積量最少。

2.3 實驗分析

通過對第1、3、6、9天這4組數據進行總結，并歸類進行半定量分析，得出幾類主要物質的變化趨勢（圖4）以及這些物質的變化規律。

2.3.1 飽和烷烴及環烴類

在所有物質中，對比變化最明顯的是正構烷烴，在第1～3天，從正二十一烷到正三十三烷百分含量都有所增加，主要原因是水解作用下，煤結構中的烷基側鏈被打斷。在第3～6天，所有檢測到的正構烷烴的含量開始減少，說明正構烷烴已經開始被微生物降解。在第6～9天，正構烷烴的數量又出現增長，或許是微生物分解烷烴的速率小于煤中大分子物質被降解的速率。同時，在第6～9天出現了很多異構烷烴（2,6,11-三甲基十二烷、2,6,10-三甲基十五烷、2,6,10,15-四甲基十七烷、6-丙基十三烷和植烷），這些異構烷烴可能由煤中大分子分解斷裂形成。

表1 第1、3、6、9 天測試的物質百分含量對比表

表2 第1、3、6、9天小分子揮發性脂肪酸物質累積量表

圖4 產氫過程主要大類物質百分含量變化趨勢圖

長鏈脂肪烴及環烴在第1天基本未檢出，而后呈現出先增后減再增的趨勢，這主要是由于長鏈飽和脂肪烴及環烴類物質存在于煤的大分子結構和低分子化合物，呈現先增加的趨勢是由于在剛開始反應的第1～3天內，煤中小分子物質與大分子之間結合的EDA鍵中部分活潑的氫鍵及化學鍵斷裂，小分子中的烷烴類物質溶出，因此含量增加；之后在產氫高峰期被生物酶利用，發生羧化反應進一步生成脂肪酸，因此在第3～6天內含量減少；但隨著反應的進行，煤的三維大分子結構部分被木質素分解菌及纖維素菌利用，導致大分子上的橋鍵及活潑官能團被破壞，因而到產氫末期，烷烴類物質出現增加的趨勢。

2.3.2 酸類

液相產物中所檢測出來的酸類主要包含小分子揮發性脂肪酸和芳香酸，還有少量的棕櫚酸和辛酸。棕櫚酸的含量在第3～6天有微弱的減少，原因是棕櫚酸會被發酵細菌利用，從而分解成更為簡單的產物。辛酸的出現一部分來源于長鏈脂肪酸的分解，另一部分則來源于煤中大分子鏈的斷開。在產氫過程中，酸的主要來源包含2個部分，一部分來自于煤中低分子化合物，因為低分子化合物本身就含有少量的酸類物質，但這一部分含量較少；另一部分來自于產氫產乙酸菌的產酸階段，在這一階段，部分脂肪烴類及芳香烴類物質被產氫產乙酸菌、發酵菌等當作有機碳源加以利用，代謝產物就是脂肪酸及芳香酸類物質。而這些菌屬于兼性菌類，體內可同時發生氧化還原2種反應。

芳香小分子酸在產氫過程中發生的增加、減少、再增加、再減少的震蕩式變化過程，對應小分子物質釋放、微生物利用、烴類氧化及大分子再被降解這一系列生物化學反應過程（圖5）。小分子揮發性脂肪酸含量雖少，但卻在產氫過程中逐漸積累（圖6）。原因在于產氫初期的水解階段，復雜有機質被分解為乙酸等小分子酸，使其含量增加；隨著反應的進行，產氫產乙酸菌開始降解小分子化合物，降解產物主要是乙酸和丁酸，故而乙酸和丁酸的相對含量較高；而在產氫末期，丁酸被消耗，可能的原因是丁酸被分解為乙酸或丙酸，這和乙酸、丙酸的累積量升高有關。同時，脂類、醛類、酮類物質含量的減少，也是造成小分子脂肪酸含量升高的原因。

2.3.3 多肽及氨基酸類物質

圖5 芳香酸類物質百分含量變化情況圖

圖6 小分子揮發性脂肪酸類物質累積量變化情況圖

氨基酸類物質最早來自于成煤植物過程中的蛋白質類物質，如戊內酰胺。在成煤過程中，蛋白質是比較容易被分解的活潑有機物，在泥炭化作用的早期氧化階段，蛋白質在各種蛋白酶的作用下分解為NH3、CO2等氣體而逸散，當未完全分解的蛋白質進入還原層以后，就會被保留下來繼而轉化為煤的組成部分。在產氫過程中，氨基酸類物質變化情況是在第1～3天先減少，而后在第3～6天再增加，產氫末期又減少（圖7）。其原因在于，蛋白質類物質活潑且易被利用，因此在產氫初期就能被許多兼性菌攝取，所以物質含量先減少；而隨著反應的進行，在產酸階段時，更多的酰胺鍵斷裂生成氨基酸等物質，導致其含量增加；最后由于厭氧氨氧化菌的作用促使其進一步分解導致物質含量減少。

圖7 氨基酸類物質百分含量變化情況圖

2.3.4 脂類化合物

大部分脂類化合物在成煤過程中能夠完整地保存下來，甚至在顯微鏡下也能夠明顯觀察，但在液相代謝產物中無法檢測出。而本實驗檢測出的甘油和甘油酯屬于脂類化合物中較容易被利用的成分，其變化情況如圖8所示。在產氫初期所檢測出的甘油及甘油酯含量很低，近乎為0；產氫高峰期，煤中的大分子結構開始分解產生甘油和甘油酯，導致百分含量不斷升高；在產氫末期，在發酵細菌的作用下，甘油和甘油酯被利用產生酸類物質，其百分含量降低。

圖8 脂類化合物百分含量變化情況圖

2.3.5 少量醛、酮類物質

在烴類物質的不完全氧化反應中，有部分物質轉化成了中間過程產物醛類及酮類物質，而最終轉化為酸。產氫過程屬于產甲烷的前提階段，其最終代謝產物主要是小分子酸類物質，因而在產氫階段結束后反應液的pH值會明顯下降，而此時的酸類物質也為后續乙酸發酵產甲烷過程提供了有效利用體。

3 結論

1）褐煤厭氧發酵過程中液相產物的變化規律和氣相產物氫氣的變化相對應。在產氫初期，產氫菌無法直接利用大分子物質，所以產氫量較少，在發酵菌、水解菌等微生物的作用下，煤中復雜有機質被轉化為相對簡單的烷烴類、小分子揮發性脂肪酸等物質；在產氫高峰期，氫氣的產生和酸類物質有直接的關系，在生物酶的催化作用下直鏈烷烴發生羧化反應進一步生成脂肪酸，導致烷烴減少，酸類物質增加，從而使產氫量到達一定的峰值；在產氫末期，在產酸菌的進一步作用下，降解反應繼續進行，揮發性脂肪酸含量增加較多，導致培養環境pH值過酸化，產氫菌活性降低，產氫速率受到抑制，氫氣的產量下降。

2）小分子揮發性脂肪酸在產氫過程中逐漸積累，芳香小分子酸在產氫過程中發生的增加、減少、再增加、再減少的震蕩式變化過程，分別對應小分子物質釋放、微生物利用、烴類氧化及大分子再被降解這一系列生物化學反應過程。液相產物中檢測出的脂類、醛類、酮類物質是產酸的母源物質，其變化量與酸類增長具有一定關聯。

3）通過對褐煤厭氧發酵產氫液相中間產物及相互轉化規律的研究，不僅有助于對發酵過程中液相中間產物進行全方面的了解，而且還揭示了產氫過程氣—液兩相之間相互對應的生物化學效應，同時對深化煤發酵產氫機理具有長久而深遠的意義。