殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠抗菌止血作用的研究

歷雪，王思穎，丁雪，張冬嬌，何秀霞

（長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

全球每年因為細菌和病毒感染致死的人數約占全球死亡率的三分之一。感染方式有吸入帶病菌的空氣、傷口接觸帶病菌的物體、食用帶病菌的食物等。細菌感染導致的常見病有破傷風、肺炎、傷寒等，一些細菌甚至能夠引起癌癥［1］?？咕牧现妇哂袣缁蛞种萍毦δ艿男滦凸δ懿牧?。目前抗菌材料更多的指通過添加抗菌物質，從而使材料具有抑制或殺滅表面細菌能力的新型功能材料，如抗菌塑料、抗菌纖維和抗菌金屬材料等［2］。

無機金屬抗菌材料耐熱性好、抗菌范圍廣、抗菌力強、持久性好、毒性低、無味且無耐藥性。Bin Zhang等人［3］選用銀離子為抗菌離子，硝酸丙二酸酯作為添加劑，制備出抗菌材料。結果表明，這種新型無機抗菌材料具有良好的熱穩定性和光穩定性。但無機材料制造工藝復雜困難，且有限制性，如銅系抗菌劑顏色較深，銀系抗菌劑易氧化變色且價格昂貴，鋅及其他金屬抗菌效果則相對較差。有機抗菌材料來源廣泛、技術成熟方便、殺菌效果好、范圍廣、顏色穩定性好、價格低。閆思思［4］分析了小分子季銨鹽和高分子季銨鹽的抗菌特點、原理、性能及小分子季銨鹽構效關系等，進一步推進季銨鹽的研究與發展。Delaviz Yasaman等人［5］通過共價將環丙沙星（CF）結合到交聯的二價寡聚物的主干上從而實現了抗菌功能。但是有機低分子抗菌劑存在毒性、安全性差、不耐熱、化學穩定性較差、易水解、易使微生物產生耐藥性、壽命短等缺點。天然抗菌材料廣譜抗菌、天然環保、無毒無害、生物相容性好、來源廣泛。María Angélica Gómez等人［6］分析了甲殼類/軟骨素類硫酸酯類凝膠懸浮質凝膠的抗菌活性，發現象蒜萃取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有活性，揭示了天然提取物的治療潛力。其缺點是不耐熱，產量受企業的生產規模和工藝條件限制，藥效普遍較短。

為此研制出互補的復合型抗菌材料顯得尤為重要。J.Kratochvíl等人［7］發現用適當定制數量的 Cu NPs和C：F形成的納米復合材料對大腸桿菌提供強烈的抗菌作用而對細胞沒有任何傷害。Michael Arkas，G等人［8］采用兩種仿生反應得到二氧化硅/超支化聚（乙烯亞胺）（PEI）/銀納米顆粒，發現它們對大腸桿菌、銅綠假單胞菌以及金黃色葡萄球菌的抗菌活性優良。Xiaoli Liu等人［9］共同制備了良好的生物相容性、無細胞毒性和低溶血性的殼聚糖寡糖-N-氯磺酸曼尼希堿（COS-N-MB）的新型無毒抗菌材料。

1 實驗方法

1.1 迷迭香提取物的制備

將100g迷迭香研磨清洗后用400mL的80%的乙醇溶液浸泡24h，要求水面淹沒迷迭香表面。之后將浸泡液分裝進50mL離心管超聲破碎30min，將濾液在60℃條件下蒸發，濃縮至100mL。將超聲后的提取液在4℃、12000r/min的條件下離心10min，取上清液。用濾器過濾除菌，得到100mL乙醇中含有100g迷迭香提取物，即得到100mL的1g/mL的迷迭香醇提物。

應用二倍稀釋法對以上得到的迷迭香醇提物進行稀釋，得到100mL的0.5g/mL迷迭香醇提物和100mL的約0.125g/mL的迷迭香醇提物，將三種濃度的醇提物密封在4℃的冰箱保存待用［15］。

1.2 制膠

低分子量殼聚糖（LMW殼聚糖）和高分子量殼聚糖（HMW殼聚糖）與不同濃度迷迭香混合，冷凍干燥法，得到殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠的樣品與迷迭香的干粉［16］。

1.3 表征

1.3.1 掃描電鏡及傅里葉紅外光譜表征

將以上制備成功的殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠表面噴金后，用掃描電鏡觀察，并且拍下電鏡照片；并且應用傅里葉紅外光譜測量多孔干凝膠和迷迭香干粉的紅外光譜。

1.3.2 孔率檢測

取制備出來的8份多孔干凝膠樣品，稱取質量m0；取燒杯加滿無水乙醇，稱質量m1；把干凝膠樣品分別加入吸飽水分，去除多余的乙醇，稱質量m2；移除吸飽水分的樣品，稱質量m3。按照公式（1）計算（ρe表示無水乙醇的密度），得出各個樣品的孔率，并且以孔率為縱軸干凝膠種類為橫軸做柱形圖。

? 插 圖 出 自 L.D.Ettlinger,“The Pictorial Source of Ripa's'Historia'”,Journal of the Warburg and Courtauld Institutes,vol.13,no.3/4,1950,圖版 63。

1.3.3 吸水率檢測

分別取8份干凝膠樣品，分別稱取質量m0；把其分別浸入乙醇溶液中0.5h，取出，用濾紙除去樣品表面溶液，稱取樣品質量m1；按照公式（2）計算得出吸水率，以吸水率為縱軸種類為橫軸做折線圖。

1.3.4 降解率檢測

取這8種干凝膠各9份，每份20mg左右，每份計質量m0；樣品浸入10mL PBS溶液中，置入恒溫振蕩箱，37℃，30r/min持續振蕩；每天隨機取8種干膠各3份樣品進行蒸餾水漂洗凍干，稱質量mt，持續三天。按照公式（3）計算降解率，以時間為橫軸、降解率為縱軸得到折線圖。

1.3.5 體外藥物釋放測試

測定迷迭香的最大吸收峰λ，并以λ為波長進行不同濃度迷迭香溶液（X）的吸光光度（Y）的測定，繪制迷迭香濃度-吸光光度標準曲線，得到其線性方程記錄待用。而后做釋放測試，即取干凝膠干燥式樣M0（約10mg）；分別置入25mL的PBS（PH=7.4）溶液中，封緊燒杯，于37℃恒溫震蕩箱30r/min持續震蕩，每隔一定時間（0-72小時內每12或24小時）取5mL釋放液，在上述得到的波長λ下測量其吸光光度值A，并向其中補充相同體積和溫度的PBS溶液；把得到的吸光光度值A帶入迷迭香濃度-吸光光度標準曲線方程得到相應的濃度C（此濃度就是干凝膠里的迷迭香成分釋放出來的濃度）；用濃度C和已知的釋放液體積5mL得出迷迭香的釋放質量M1。由公式（4）可計算累積釋放量，以時間為橫軸累計釋放量為縱軸做折線圖［17］。

1.4 抑菌試驗

制作濾紙片成直徑6mm，在121℃條件下干熱滅菌20min，冷卻備用。將濾紙片分別浸泡在1g/mL、0.5g/mL、0.125g/mL的迷迭香濃度迷迭香醇提物里，使其充分潤濕，將含有迷迭香提取物的濾紙片晾干后用燒灼滅菌的鑷子分別貼于含菌培養基表面，相互間要間隔一定距離，使濾紙片與培養基表面密貼；將制備好的含0.125g/mL、1g/mL迷迭香濃度的干凝膠和純殼聚糖干凝膠制備成直徑為6mm的圓型樣品，分別浸入0.1mol/L的PBS溶液中，后在紫外線下消毒30min；取第一步制成的菌懸液1mL均勻涂布在固體培養基平板表面，用無菌鑷子將各樣品分別貼在含菌平板上，每個平板貼四個，標記好種類；于37℃下培養24h，之后取出測定抑菌圈直徑并記錄以及得到抑菌圈的照片［18］。

1.5 體外凝血實驗

采取人血液加入抗凝血劑檸檬酸鈉（血∶抗凝血劑體積比為9∶1）制成血液樣本逐滴加入1cm2的正方形樣品表面，恒溫振蕩10min，緩慢加入50mL去離子水，37℃恒溫以100r/振蕩5min；取上步的溶液用紫外分光光度計在415nm波長下測量吸光光度值A（將0.1mL血用去離子水稀釋為50mL后的吸光光度值作為A0），按照公式計算凝血指數［19］。

1.6 生物相容性

取96孔板，各孔加入100μL的細胞懸液；細胞貼壁后加入材料培養24h后，每孔加入10μL的5g/L的MTT溶液，37℃下培養4h；把培育好的細胞吸棄上清液，向樣品中加入75μL二甲基亞砜，震蕩10min，使結晶物充分溶解；用酶聯免疫檢測儀在490nm波長下測量吸光光度值A。得到以種類為橫軸、吸光度值為縱軸的柱形圖［20-21］。

2 結果與分析

2.1 干凝膠成品掃描電鏡

掃描電鏡的結果圖1（a）與圖1（b）表明純殼聚糖多孔干凝膠與摻加了迷迭香醇提物的殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠的孔徑都較大，結構較為完整。

圖1 掃描電鏡照片

2.2 傅里葉紅外光譜

圖2的紅外光譜1500cm-1處是芳香環的骨架震動吸收峰，顯示出殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠中存在芳香環結構，殼聚糖與迷迭香醇提物混合成功。

圖2 傅里葉紅外光譜0、0.5、1代表迷迭香濃度，單位g/mL

2.3 孔率

圖3表明，高分子量的殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠孔率在61.75%到83.19%之間，低分子量的孔率在75.06%到79.67%之間，大的孔率有利于在傷口處大量吸附血液形成血塊從而止血。

圖3 孔率的柱形圖其中h代表HMW，l代表LMW，0、0.125、0.5、1代表迷迭香濃度，單位g/mL

2.4 吸水率

圖4（a）LMW的殼聚糖多孔干凝膠最大吸水率在迷迭香濃度0.5g/mL左右，圖4（b）HMW的的最大吸水率在迷迭香濃度為0.125g/mL左右。大的吸水率意味著可以大量的吸收水，當與傷口接觸的時候可以使傷口保持濕潤的狀態，更好的發揮止血的作用，從而加速傷口的封閉和愈合。

圖4 殼聚糖多孔干凝膠的吸水率0、0.125、0.5、1代表迷迭香濃度，單位g/mL

2.5 降解率

圖5（a）為LMW多孔干凝膠的降解效率圖，隨著時間的延長LMW多孔干凝膠72h的降解率為41.67%到71.07%，圖5（b）為HMW多孔干凝膠的降解效率圖，隨著時間的延長HMW多孔干凝膠72h的降解率為31.85%到84.35%，這意味著其可以很快的被吸收或者代謝出體外。

圖5 殼聚糖多孔干凝膠的降解率0、0.125、0.5、1代表迷迭香濃度，單位g/mL

2.6 體外藥物釋放率

y=5.0638x+0.1784（R2=0.9846）為標準曲線計算得公式，圖6（a）LMW殼聚糖多孔干凝膠和圖6（b）HMW多孔干凝膠的體外藥物釋放率都在24h到48h之間達到百分百的釋放，保證了藥物對患處的醫治效果。

圖6 殼聚糖多孔干凝膠釋放率0.125、0.5、1代表迷迭香濃度，單位g/mL

2.7 抑菌實驗

圖7 殼聚糖多孔干凝膠抑菌效果圖圖中0、1、2、3分別表示0g/mL、0.125g/mL、0.5g/mL、1g/mL迷迭香濃度

表1 LMW多孔干凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌圈

表2 HMW多孔干凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌圈

圖7（a）為LMW的殼聚糖多孔干凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌圈，圖7（b）為HMW的殼聚糖多孔干凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌圈，表1為LMW的殼聚糖多孔干凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑、表2為HMW的殼聚糖多孔干凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑，可以從中看出該樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌效果非常顯著。摻雜了迷迭香的多孔干凝膠抑菌效果隨著迷迭香的濃度的增大而增大，LMW與HMW的殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠的抑菌效果差異不大。利用相同方式檢測分析出其對沙門氏菌、大腸桿菌也具有明顯的抑菌效果，同時也符合迷迭香濃度越大而抑菌效果越好的特點。樣品對于實驗用的三種菌的抑制效果為對金黃色葡萄球菌的抑制效果＞對沙門氏菌的抑制效果＞對大腸桿菌的抑制效果。

2.8 體外凝血實驗

圖8（a）LMW的凝血效果會稍微的劣于圖8（b）HMW的殼聚糖多孔干凝膠，摻加了迷迭香之后的凝血效果最佳都是在其濃度為0.5g/mL左右。

圖8 殼聚糖多孔干凝膠的凝血指數0、0.125、0.5、1代表迷迭香濃度單位g/mL

2.9 MTT測細胞活性實驗

圖9可以看出加入了材料的細胞的活性有增加的趨勢，殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠對細胞無傷害作用，低分子量和高分子量殼聚糖的區別并不明顯，隨著的迷迭香濃度增加多孔干凝膠對細胞的培養效果更好。

圖9 MTT 24h的實驗結果

3 結論

通過掃描電鏡可以看出殼聚糖多孔干凝膠具有較大的孔徑，傅里葉紅外光譜顯示出迷迭香成分與殼聚糖成分充分混合了。

殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠具有很大的孔率，其中高分子量的殼聚糖多孔干凝膠孔率高于低分子量的殼聚糖多孔干凝膠。殼聚糖多孔干凝膠具有自身效果5到10倍的吸水效果，其中低分子量摻雜了迷迭香醇提物的最好吸水率在迷迭香濃度為0.5g/mL左右，高分子量摻雜了迷迭香醇提物的最好的吸水率在迷迭香濃度為0.125g/mL左右的時候。殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠還具有很好降解率，隨著時間的增加不斷增強，在72h的時候已經可以降解到80%左右。同時其具有很好藥物釋放率，低分子量殼聚糖多孔干凝膠和高分子量多孔干凝膠的體外藥物釋放率都在24h到48h之間達到百分之百。

單純的殼聚糖多孔干凝膠對各種菌株的抑菌效果并不明顯，混雜了迷迭香醇提物的的樣品對金黃色破萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等卻具有較為明顯的抑菌效果，抑菌的效果隨著迷迭香濃度的增加而變好，其中其對金黃色葡萄球菌抑菌效果最為突出，低分子量殼聚糖與高分子量殼聚糖的抑菌效果差異不大。

當迷迭香濃度為0.5g/mL的時候凝血效果最好，其中高分子量的凝血效果更好一些。

殼聚糖/迷迭香多孔干凝膠對細胞無傷害作用，低分子量和高分子量殼聚糖的區別并不明顯，隨著的迷迭香濃度增加多孔干凝膠對細胞的培養效果更好。

綜合以上所有實驗數據確定高分子量殼聚糖+0.5g/mL迷迭香為實驗篩選得到的良好的抑菌兼凝血材料。