43種植物CaM1基因密碼子使用特征及遺傳差異分析

李晨輝 趙子捷 陳文燁 焦義然 楊帆 劉永偉 董福雙 杜進民 周碩

摘要：為深入了解不同類植物CaM1基因（calmodulin 1，簡稱CaM1）在抵抗逆境進化過程所形成的密碼子的使用特征和遺傳差異。運用CodonW、BioEdit和MEGA軟件對43種植物序列進行分析，并構建系統發育樹。結果表明，CaM1基因對密碼子的使用具有極強的偏好性，CUC、AUC、UCU、CCA、ACU、UGA為其最優密碼子，禾本目植物更偏好使用G/C堿基。G、C堿基含量和位置是引起CaM1基因密碼子偏性的主要原因。遺傳距離分析表明，山柑目與白花菜目之間的親緣關系最近，豆目和無患子目間的親緣關系次之，與聚類分析結果相符。

關鍵詞：CaM1;密碼子偏性;遺傳距離;親緣關系

中圖分類號： S188? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0028-04

收稿日期：2017-11-30

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：31600216）;河北省自然科學基金青年基金（編號：C2017301066）;河北省現代農業創新工程項目（編號：2019-4-8）。

作者簡介：李晨輝（1984—），男，河北保定人，博士，工程師，主要從事生物工程研究。E-mail：li.chen.hui@163.com。

通信作者：杜進民，博士，教授，主要從事生物技術研究，E-mail：13933106571@163.com;周 碩，博士，副研究員，主要從事植物分子遺傳學研究，E-mail：zhoushuobio@163.com。

植物體內存在眾多的信號通路，其中鈣離子介導的細胞生命活動是其重要的調節機制之一[1]。鈣調素（calmodulin，簡稱CaM） 不僅參與信號轉導[2]，其活化后還能結合多種酶來調節酶活性，形成相應的生理生化反應，從而對植物細胞分裂、伸長、生長、發育和抗逆等活動進行調節[3]，并對花粉萌發和花粉管伸長具有促進作用[4]。在一種植物體內，可存在多種CAM亞型基因，且不同亞型基因間的序列具有高度的同源性，但存在的這些差異也使其不同的亞型具有相應的生理功能[5-6]。脫氧核糖核酸或核糖核酸與其編碼蛋白之間的關系可以通過密碼子來表示[7]。一共有64種遺傳密碼來編碼20種氨基酸[8]，這種編碼同一個氨基酸的密碼子稱為同義密碼子，在翻譯成氨基酸的整個環節中，基因對同義密碼子的使用具有不平衡性，還存在物種的差異性等特征[9]?；蛎艽a子偏好性的研究有利于基因水平轉移及其家族分化的研究[10]。因此，CaM1基因密碼子偏好性的分析能更好地揭示其在系統分類研究中的有效性。

在同一種植物體的不同組織和不同發育階段，CaM基因的表達存在差異[11]。程玉豆等克隆出鴨梨CaM基因2種亞型（命名為PbCaM1和PbCaM2），發現這2種亞型在成葉、盛花期花瓣及幼果期的表達量較高[12]。郭麗君發現美國山核桃CaM基因在不同組織和發育階段也不一致，在葉中的表達量最高，其次分別是嫩葉和內莖[13]。趙芊等在研究擬南芥7個CaM亞型基因時發現，不同亞型的表達量均受到細菌信號3-羰基辛?；呓z氨酸內酯不同程度的誘導，且野生型CaM1基因處理6 h達到表達高峰[5]。薛敏等在非生物脅迫條件下，克隆出沙冬青CaM1基因，通過RT-PCR方法證實其在低溫、干旱和鹽脅迫下表達水平上調[14]。趙晶等發現灰皮支黑豆和感病品種遼豆15根部在線蟲侵染后的第5天，抗感品種的CaM1基因的表達量最高[15]。

對植物CaM1基因在不同條件下的表達量進行深入研究，對揭示鈣離子參與的信號通路有重要意義，但目前為止還未見CaM1基因密碼子使用模式的報道，這對后期開展異源表達和遺傳轉化相關試驗都是不利的。本研究以43種植物CaM1基因密碼子使用特征為切入點進行其進化和分類的研究，通過CodonW分析了43種（12類）植物CaM1基因密碼子偏好性，運用Bioedit和MEGA軟件對遺傳距離和親緣關系進行分析，以期為CaM1基因在植物中的進化和分類提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗的時間和地點

本試驗于2017年進行，目的基因的搜集在河北科技大學生物科學與工程學院完成，生物信息學分析在河北菲尼斯生物技術有限公司和河北省農林科學院遺傳生理研究所完成。

1.2 目的基因的導入

本研究所用基因資料都來源于Nucleotide（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）數據庫，43種植物CaM1基因含有禾本目、薔薇目、管狀花目、白花菜目、山柑目、傘形目、茄目、豆目、菊目、鼠李目、無患子目和蕓香目。43種植物CaM1基因序列都是完整的編碼區序列，序列全長為450 bp。如表1所示，利用MEGA 6.0對上述序列進行堿基分析。

1.3 不同密碼子使用偏性指標分析

利用CodonW軟件計算ENc、GC、GC3s、CBI和相對同義密碼子使用度（relative synonymous coon usage，RSCU）的值，分析CaM1基因密碼子使用偏性; 并計算GC、GC3s、蛋白質親水

1.4 遺傳距離和系統發育樹的構建

利用BioEdit軟件對43種植物CaM1基因cDNA序列進行比對，將比對結果保存為fasta格式，通過MEGA軟件中Kimura雙參數模型計算遺傳距離。利用MEGA軟件的鄰近法建立系統發育樹，并通過自舉檢驗法（Bootstrap method=1 000）校正。

2 結果與分析

2.1 不同植物CaM1基因序列堿基特征

如表1所示，編碼CaM1基因的43種植物的核苷酸全長均是450 bp。在ATCG堿基分布中，禾本目的小麥、玉米、水稻、二穗短柄草、大麥和甘蔗，薔薇目的節節麥、小米、花生、蕓豆和綠豆，管狀花目的芝麻，白花菜目的蕪菁和醉蝶花，上述物種的A+T堿基含量均低于G+C堿基含量，其余物種G+C堿基含量高于A+T堿基含量，表明CaM1基因更傾向于使用G或C堿基。

2.2 密碼子使用偏性指標及其影響因素分析

如表1所示，玉米的ENc值最小，為29.15，且禾本目其余植物的ENc值也明顯小于其他植物，表明禾本目的植物對密碼子使用具有較強的偏好性，43種植物中，只有12種植物的ENc值高于55，ENc值最高的植物為鷹嘴豆和葡萄（ENc=61.00），表明大多數植物CaM1基因對同義密碼子的使用具有較強的偏好性。禾本目植物的GC含量值和密碼子第3位的GC含量值是所有植物中最高的，表明禾本目植物偏愛使用G、C堿基。在43種植物中，禾本目的玉米、水稻，薔薇目的小米，白花菜目的醉蝶花，山柑目的擬南芥、亞麻薺的CBI值均大于0.2，禾本目的二穗短柄草、大麥，薔薇目的節節麥、花生，白花菜目的蘿卜、蕪菁的CBI值均大于0.1，其余植物的CBI值接近0，表明禾本目、薔薇目、白花菜目和山柑目的CaM1基因密碼子使用偏好性大于其他植物。同義密碼子相對使用度的結果表明，43種植物對CUC、AUC、UCU、CCA、ACU、UGA（終止密碼子）、CAU和UGC具有極強的偏好性（RSCU>1.5），除上述密碼子外，禾本目植物更偏向使用GUC、UCC、UCG、AGC、ACC、UAC、CAG、GAG、CGC、GGC（RSCU>1.5），這與其他11種分類植物密碼子的使用特征不一致。如表2所示，GC含量和密碼子第3位的GC含量均與密碼子偏愛指數呈極顯著正相關，但與有效密碼子數呈極顯著負相關，表明G、C堿基的含量和位置對CaM1基因密碼子偏性具有重要影響。

2.3 不同植物CMA1基因的遺傳距離分析

不同植物種群間Kimura雙參數距離如表3所示，各分類群體間遺傳距離變異區間在0.11～0.22之間波動，其中山柑目和白花菜目之間的遺傳距離最近，雙參數距離值為011，其次是豆目和無患子目。白花菜目與菊目、山柑目與蕓香目之間的遺傳距離最遠，雙參數距離值均為0.22，其次是豆目與菊目、白花菜目與管狀花目、白花菜目與蕓香目。

2.4 不同植物CMA1基因的聚類分析

如圖1所示，43種植物明顯分為5類：禾本目（小麥、玉米、二穗短柄草、大麥、甘蔗）和薔薇目（節節麥、小米、花生、蕓豆、綠豆）間的親緣關系較近;薔薇目（蒺藜狀苜蓿、豌豆、木豆）與豆目（大豆、狹葉羽扇豆、鷹嘴豆）和無患子目（冬青）間的親緣關系較近;薔薇目（蘋果、白梨），傘形目（人參、西香芹菜），鼠李目（葡萄、棗）和蕓香目（克萊門柚）間的親緣關系較近;管狀花目（番茄、馬鈴薯、矮牽牛）和茄目（簇生椒、煙草）間的親緣關系較近;白花菜目（小鹽芥、蘿卜、蕪菁、醉蝶花）和山柑目（擬南芥、亞麻薺）間的親緣關系較近，且同一目下的各個植物間的親緣關系更近。

3 討論與結論

密碼子偏好性的研究為了解物種起源于進化、目的基因的改造、推測未知基因表達水平及預測目的基因最佳宿主奠定了理論基礎[16-17]，同時為轉基因研究中的甲基化能否引起基因表達量下降或基因沉默提供參考[18]。

本研究通過分析43種不同植物的密碼子使用特征，發現其有效密碼子數（29.15≤ENc≤61.00）和密碼子偏愛指數這2種指標表明不同植物CaM1基因對密碼子的使用具有極強的偏好性，通過GC含量、密碼子第3位的GC含量和同義密碼子相對使用度這3種指標證實不同植物CaM1基因對G、C堿基的使用有極強的偏好性，尤其是對終止密碼子UGA，以及CUC、AUC、UCU、CCA、ACU密碼子的使用。禾本目與其他分類植物相比，更傾向于使用G/C結尾的堿基，引起其GC3s值遠遠高于其他植物，且GUC、UCC、UCG、AGC、ACC、UAC、CAG、GAG、CGC、GGC為其最主要的偏愛密碼子。分析影響CaM1基因密碼子使用偏性的原因發現，G、C堿基的含量和位置對CaM1基因密碼子偏性具有重要影響。關于影響密碼子偏好性的原因，有研究報道，反轉錄形成的cDNA序列長度、轉運RNA豐度、突變和自然選擇等都可造成基因對某些密碼子的使用具有極強的偏好性[19]。GC堿基含量會造成同義密碼子在使用上具有偏好性的特點，且其偏好性越強，發現該基因以G/C堿基結尾的可能性越大，而且GC3s對該基因密碼子偏好性有主導作用[20]。每種生物都有可能面臨非自然選擇壓力，這種非自然選擇壓力會促使物種的密碼子第3位堿基種類發生變化[21]。蘇麗艷等發現蘋果CaM基因有響應損傷、高溫、低氧等非生物脅迫的能力， 在適應脅迫環境初期過程中不可或缺[22]。在體溫脅迫下，茶樹CaM蛋白也可介導鈣信號從而提高適應低溫環境的能力[23]。趙存鵬等發現棉花在脅迫處理后，轉入CaM基因能提高棉花抵御低溫的能力[24]。

基因DNA水平上的分析更有利于基因功能信息的獲取，本研究分析12種不同分類植物CaM1基因的遺傳距離發現，山柑目與白花菜目之間的遺傳距離值最小，其次是豆目和無患子目，這與基于鄰近法構建的聚類圖一致，表明遺傳距離和聚類分析都能描述物種間的親緣關系。CaM1基因密碼子使用特征的確定為研究影響植物抗逆因素及開展抗逆品質改良奠定基礎，并為深入建立轉基因表達系統提供最優密碼子的理論依據。

本研究分析了43種植物CaM1基因密碼子使用特征，發現不同類植物CaM1基因對密碼子的使用具有較強的偏好性，尤其偏好使用G/C堿基，CUC、AUC、UCU、CCA、ACU和UGA為最優密碼子，禾本目植物更偏向使用G/C結尾的堿基。G、C堿基的含量和位置是影響CaM1基因密碼子偏性的主要原因。遺傳距離分析得出的親緣關系與系統發育結果一致。

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