VS120虛擬數字切片掃描系統的應用和管理

尹 偉， 劉雙雙， 方三華

(浙江大學 醫學院，杭州 310058)

0 引 言

圖像拼接技術在現代醫學研究領域發揮了巨大的作用，由于組織切片或者活體動物較大，使用高倍物鏡時分辨率高，但視野狹窄，低倍物鏡相對視野大，但分辨率低，只能觀察樣本局部，很難了解整體。利用圖像拼接技術，可獲取一個高分辨率的完整組織圖貌。激光共聚焦顯微鏡(Confocall Laser Scanning Microscope,LCSM)的拼接功能解決了在高放大倍數下，在單幀顯微圖像中無法獲取所觀測對象全貌的問題。曾毅波等[1]將激光共聚焦顯微鏡技術應用于微機電系統中，在懸臂梁的形貌分折中獲得清晰的三維圖像，運用拼接功能獲得384 μm×288 μm的視場面積。Kulesa等[2]結合拼圖技術，在8個視野中利用共聚焦技術和雙光子技術進行光活化和多點掃描，提供了一種更有效率，減少侵入性的技術來跟蹤斑馬魚細胞的運動，但是這些傳統方法耗用的時間較長。隨著細胞生物學、神經生物學和發育生物學等學科的發展，對大視野拼圖的成像速度提出了越來越高的要求。

虛擬切片(Virtual slides)又叫數字切片(digital slides)，是利用計算機結合顯微鏡攝影技術，將一張傳統的組織切片轉化為全視野的數字化虛擬切片，并保持完整性和真實性[3-4]。虛擬切片技術應用廣泛，可應用于常規HE染色、特殊染色、熒光染色的組織切片。VS120是奧林巴斯為全視野大面積掃描和高分辨率圖像采集專門設計推出的數字切片掃描系統，可用于明場和熒光觀察，能滿足快速大視野無縫拼接和高分辨率細節成像，是組織病理學、神經生物學、發育生物學等眾多學科都需要的重要工具，能大大提高熒光成像的質量和速度，存儲方便檢索迅速，隨意選擇放大倍率，實現精確的圖像處理和分析從而提高了研究人員的工作效率。本文對VS120虛擬數字切片掃描系統的硬件配置和軟件功能進行詳細介紹，結合具體使用實例探討該儀器的應用。由于該儀器實行校內外共享服務，是醫學院公共技術平臺中使用頻率較高的儀器之一，在管理和維護方面需要達到更高的標準?？偨Y使用過程中遇到的常見問題，分析造成的原因，并提出對策，以期為數字切片掃描系統的共享使用提供重要借鑒和參考。

1 配置參數及成像特點

(1) 相機。采用2/3 in 500萬像素彩色高分辨率相機(Charge Coupled Device,CCD)成像,色彩還原性優異。

(2) 顯微鏡。研究級BX61顯微鏡,高精度電動載物臺，可實現全視野樣品的自動化精確無縫圖像拼接，復眼透鏡呈現更均勻明亮的熒光。標配有2倍、10倍、20倍和40倍4款尖端物鏡，并有60X、100X多款油鏡可供選擇。

(3) 濾色片。配置高速熒光激發及吸收濾色片轉輪8孔位，最多可進行13通道成像，切換時間約58 ms，每一通道可單獨調整曝光時間和Z軸焦平面位置，保證最佳焦平面激發。

(4) 切片加載系統。VS120-S6-W切片加載系統允許手動加載1～6片標準切片。為了高通量研究和病理學分析，VS120-L100-W系統配有一個高度可靠、強勁，可裝載高達100張切片的裝載系統。

(5) 軟件。軟件具有注釋、測量、景深擴展、X、Y、Z三維序列掃描、不同倍率圖層掃描、Zoom時標尺自動改變等多種功能。直觀、人性化的軟件界面可以高效地控制全電動顯微鏡，完成自動聚焦和圖像采集設置。有多種掃描模式可供選擇，如簡單的快速掃描和全程控制的專家掃描。多通道熒光圖像采集可以自動疊加，以輕松查看任意通道的圖像。

(6) 成像特點。Smart Scan掃描方式，明場成像，自動聚焦“地形圖”，智能化的“邊緣偵查”，透射光成像，平滑無縫隙圖像拼接、優異的自動和半自動對焦功能。

2 VS120在組織病理學、神經生物學、發育生物學等研究領域的應用

VS120可以在2 min內快速掃描完一張切片，創建一個數字“虛擬切片”，由于能數字化分享實驗室、教室里的切片，VS120成為研究、疾病診斷等遠程會診、病理、切片資料歸檔、課堂教學數據共享方面應用的完美之選，在組織病理學、神經生物學、發育生物學[5-11]等研究領域得到廣泛應用。文獻[12-13]中將VS120應用于神經科學研究，繪制了全腦神經地圖，Ohara等[14]將VS120應用于腫瘤方法學，研究一種多重注射針對胰腺腫瘤藥物分布的改善。在實際應用中，VS120日均預約量達8 h以上，服務醫學院內外100余個課題組，樣本量大，處于供不應求的狀態。下面列舉幾個具體案例并就感興趣區域進行細節放大，包括樣本類型、拍攝條件、拍攝參數等。

2.1 樣本類型：神經熒光腦片

拍攝條件：熒光(Fluorescence,FL) Red -20 ms，FL Green -158 ms，FL Blue -42 ms,10X物鏡。圖像大小：10 mm×7 mm。拍攝時間:47 s。具體效果如圖1所示。

圖1 神經熒光腦片成像圖(10X)

2.2 樣本類型：熒光腸切片

拍攝條件：FL Red -183 ms，FL Green -158 ms，FL Blue -126 ms,10X物鏡。圖像大?。?.8 mm×3.4 mm。拍攝時間：16.75 s。具體效果如圖2所示。

圖2 熒光腸切片成像圖(10X)

2.3 樣本類型：視網膜熒光片

拍攝條件：FL Green -110 ms,20X物鏡。圖像大?。? mm×5.8 mm。拍攝時間：38.57 s。具體效果如圖3所示。

圖3 視網膜熒光片成像圖(20X)

2.4 熒光內臟切片

拍攝條件：FL Green -150 ms，FL Blue -200 ms,10X物鏡。圖像大?。?.8 mm×5.8 mm。拍攝時間：24 s。具體效果如圖4所示。

圖4 熒光內臟切片成像圖(10X)

2.5 明場骨切片

拍攝條件：40X物鏡。圖像大?。?.8 mm×3.2 mm。拍攝時間：42 s。具體效果如圖5所示。

圖5 明場骨切片成像圖(40X)

2.6 明場腎切片

拍攝條件：40X物鏡。圖像大?。?.2 mm×10.3 mm。拍攝時間：2 min 09 s。具體效果如圖6所示。

圖6 明場腎切片成像圖(40X)

3 VS120使用過程中遇到的問題、造成原因及解決方案

問題1預覽掃描和實際掃描會因為超出掃描界限而彈出報錯提示。

造成原因在掃描過程中，利用stage navigator來進行多次重復定義預覽區域時，如果第2次預覽定義的區域小于上次定義的區域容易出現該提示。

解決方案取消掃描，在采集模塊校準界面里重新做一次預覽區域定義校準，即可解決。

問題2切片最右邊的區域位于掃描區域以外。

造成原因軟件系統在設計預覽邊界時，為了盡可能避免掃描的錯誤和節省時間，特意避開了夾片器支撐玻片的區域，所以會出現最右邊一小塊區域位于掃描界限之外。

解決方案建議制備樣品時盡量預留出周圍的區域，既可以便于指甲油封片不影響樣品成像，也可以避免樣品位于掃描區域之外。

問題3vsi格式的讀取和另存方案。

造成原因VS120進行全視野掃描的數據量十分巨大，超出了Java系統讀圖的限制，所以常規Windows讀圖軟件無法讀取超大數據量的.tiff和.jpg格式的文件。VS120軟件自身生成的格式.vsi可以很有效的存儲數據又節省空間，但是其他軟件一般情況下無法讀取。

解決方案①掃描過程中設置自動存儲，直接存成.tiff格式文件。②使用Fiji+vsi reader進行.vsi數據讀取和另存。③使用奧林巴斯提供的免費看圖軟件OlyVIA。④加配圖像批量轉換插件，可以對圖像進行批量的格式轉換和另存，可與圖像掃描同時進行。

問題440X鏡頭成像清晰度差。

造成原因①40X物鏡上面有一個校正環，用于校準蓋玻片的厚度。由于不同批次的蓋玻片厚度略有差別，所以要結合校正環一起調節使用，才能得到最佳最清晰的成像。②數字切片系統是基于寬場成像的，與共聚焦的原理不同，成像時也會采集到非焦平面的圖像信息，這是光學系統本身的特性。40X物鏡的數值孔徑更高，景深更小，所以這種現象會更加明顯。

解決方案①針對不同的樣品，對校正環進行調節，以獲得在焦面位置最清晰的成像。②基于寬場成像的原理，建議制備更薄的標本，或者使用VS120的實時EFI功能進行成像。

問題5過厚的熒光樣品和過弱的熒光樣品采集出現拼接陰影。

造成原因①過厚的熒光樣品——在進行拍攝時，很難找到比較合適的焦面，如果多個聚焦點之間的Z軸相差太大，焦面移動過程中的背景熒光亮度整體會發生變化，這樣就容易出現拼接陰影。②過弱的熒光樣品在進行采集的時候，樣品信噪比不好，為了拍攝出信號，需要提高曝光時間或者提高熒光光源的功率，容易造成樣品的淬滅。而且，此時采集到的圖像中，背景熒光亮度大部分都是自發熒光，也容易出現淬滅。系統在拼圖時需要重復拍攝邊界區域進行重疊拼接，樣品淬滅則容易出現拼接陰影。

解決方案①建議樣品厚度不要超過40 μm，熒光樣品進行焦面設置時選擇手動調焦，以保證快速確定焦面，盡量避免熒光淬滅。由于樣品比較厚，可以設置的焦面范圍相對比較寬，建議盡量保持Z軸數值一致。②熒光信號過弱的樣品信號較弱，信噪比較差，做數字切片掃描時背景信號相對被放大，容易有拼接陰影，建議改進樣品制備方法。針對熒光觀察，優先選擇延長曝光時間，而非增加光源強度，盡量避免樣品的淬滅。

4 結 語

虛擬切片技術優勢巨大，前景廣闊，逐步作為形態學實驗教學、科學研究和病理會診的一種輔助手段，相較于傳統激光共聚焦的大視野拼圖技術，VS120拼圖速度更快更高效，且拼縫更小，幾乎做到完美拼接，但其圖像質量仍取決于組織切片的制作質量，因此傳統切片還不能完全被取代[15]。對于此類共享率高、使用量大的顯微成像儀器，如何做好維護和管理并且合理地開發利用是儀器管理人員需要不斷研究和深入的問題。