蛹蟲草人工培養研究進展

楊益廣 黃作喜

摘要：蛹蟲草作為冬蟲夏草替代品，在傳統中藥上具有重要的藥用價值。近年來，由于過度采挖，導致野生冬蟲夏草資源越來越少，而蛹蟲草的人工培養已初具規模。該文綜述了蛹蟲草的菌種選育、人工培養方式、培養基制作、接種技術、培養環境調控、子實體采收、次級代謝產物提取等環節技術的研究進度，并提出了蛹蟲草人工培養的發展方向，即：以液體發酵培養實現工業化生產、降低污染率，以及提高次級代謝產物的利用率為重點。

關鍵詞：蛹蟲草;人工培養;研究進展

蟲草類藥材在中藥上具有極高的藥用價值，其中冬蟲夏草的市場價值最高。近年來，由于人們對冬蟲夏草的過度采挖，使其野生資源日漸稀少，市場需求遠大于自然生產量。而蛹蟲草作為冬蟲夏草的替代品，擁有與冬蟲夏草相似的藥用功效，且已實現人工培養和規?；a。傅明等以蛹蟲草子實體為材料，分離純化得到3種物質，均具有抗HIV-1蛋白酶活性[1]，且蟲草素、蟲草多糖等物質對于抗腫瘤、抗HIV具有重要藥效，其安全性已被國家批準認可。在人工培養條件下，蛹蟲草的蟲草素、碳氮化合物的含量等不低于甚至高于冬蟲夏草。江曉路等研究認為人工栽培蛹蟲草的SOD活性更高[2]。

目前，蛹蟲草的培養方式主要有活體人工培養、人工固體培養基培養、液體發酵培養3種，技術成熟、推廣應用廣泛，開辟了蛹蟲草新的藥材資源。本文通過對蛹蟲草的菌種培育、人工培養系列技術及未來研究開發重點等的探討，為蛹蟲草的大規模人工培養提供理論與技術參考。

1 菌種選育

1.1 菌種選育方法 菌種選育是蛹蟲草人工培養的關鍵技術環節之一。優良菌種的子實體產量，菌種的傳代次數，子實體的萌發幾率以及蟲草素的含量等，都高于劣質種源的。大部分蛹蟲草在實際生產過程中都會發生菌種退化現象，即子實體不萌發，菌種不進行生殖生長而回退到營養生長的過程，其中菌核核型的改變是大部分學者認可的菌種退化的內在原因。經相關實驗證明：蛹蟲草發生生殖生長回退到營養生長的現象，其實質是異核相轉變成同核相所致的，異核相具有2個交配型單孢子，同核相只具備1個交配型單孢子，而只有同時擁有2個交配型單孢子子實體才能夠正常生長，當蛹蟲草異核相轉變為同核相就會發生菌種退化現象，子實體不能生長。菌種退化也與菌種傳代次數、菌種選育保存條件等諸多因素有關。造成菌核核型改變的可能因素有外部環境、物理因素、化學誘變、以及遺傳等。因此，對于菌種的選育，不僅需要考慮環境、種源等外部因素，更要考慮內部遺傳因素的影響。

目前，較為成熟的菌種選育技術有組織分離、孢子培養以及雜交育種3類。組織分離是選擇優良子實體進行懸掛式分離，再接種于PDA培養基鑒別優劣，并制作保存菌種的辦法。孢子培養是指從蛹蟲草中分離單個孢子并培養成成熟菌絲，從而獲得純菌種的方法。雜交育種是指利用蛹蟲草的二極性異宗配合習性，選取優良性狀菌種雜交而獲得性狀優良、遺傳穩定的菌種選育方法。3種方法各有優劣，但以組織分離法最為簡單有效、成本低，生產上大都選用此法。王艷華等通過對尖頭及圓頭蛹蟲草組織分離和孢子分離選育研究發現，截取上部1.5cm以內的組織塊分離出的菌種相對能保證轉色出草，越靠近下部的出草率越低或不出草[3]。

1.2 表型性狀選育菌種技術 良好的表現型性狀是菌種選育的目標。袁雪芬從人工栽培的蛹蟲草子實體分離得到Az和Bz 2個群體菌株，觀察其菌落形態并從中選取部分菌株進行子實體產生實驗，結果表明，菌落顏色為杏橙色且氣生菌絲較少的菌株經搖培后的菌絲球較小，而且密集，出草率高且產量高[4]。李光榮等通過對野生蛹蟲草單孢子進行分離并進行生產子實體試驗，觀察與測定子實體所含蟲草素含量，發現菌落背面顏色呈橙鉻色的菌株容易產生子實體[5]。結合上面的方法，可以通過以下2個階段試驗選育優良菌種：第1階段，固體培養選擇菌落顏色深、氣生菌絲少的菌種進入第2階段液體搖培篩選;第2階段，通過液體揺培，觀察菌絲球形態，選擇菌絲球細小、密集的菌種用作生產種。同時要注意，菌落顏色呈橙色的菌株容易產生子實體、產量較高。

2 蛹蟲草人工培養技術

2.1 人工培養方式 自1987年梁曼逸等率先以家蠶和柞蠶為寄主培養蛹蟲草，獲得了與天然蛹蟲草相似的子實體[6]，隨后柞座蛹、蠶蛹等蛹蟲草的人工培養相繼成功，至今已出現了3種主要的培養方式：蠶蛹接種培養、人工固體培養、液體發酵培養。3種培養方式所需原料和成本都不一樣，產出產物、效率、品質的差異也十分巨大。蠶蛹接種培養是一種以活的蠶蛹為寄主，將蟲草菌種注入寄主體內，給予蟲草子實體生長適宜的環境條件，最終得到產物，所涉及的蠶蛹選擇培育、菌種的保存培養等技術都是極為關鍵的環節。該方法存在許多不足與限制，如蠶蛹生長具有季節性，不適宜連續生產蛹蟲草，注射菌液易污染，成本高、效率低，所得產物量不受控制等?；诖耍枷x草人工固體培養基培養則克服了以上的缺點，該方法通過添加營養成分，配制蛹蟲草所需營養的培養基替代蠶蛹，將蟲草菌接種在培養基上培養，國內常用大米、小麥等固體培養基，取得了較好的效果而被廣大生產者所接受。液體發酵培養是蛹蟲草人工培養領域內擁有廣闊前景的培養方式，其菌絲產量高、生長速度快、可連續生產，營養成分及所需產物量都能通過營養元素配比達到合理控制。

蛹蟲草培養對營養元素配比、空氣濕度、光照等條件的要求較為苛刻，蠶蛹接種培養以及人工固體培養受制于培養條件都難以實現機械化操作和規模培養，成本較高、易受環境影響，相比之下液體發酵培養更適合機械操作，受環境影響較小，生產條件安全可控，更適合實現工業化生產，不同培養方式的操作流程差異也較大。

蛹蟲草人工培養的基本操作流程如下：蠶蛹接種培養，菌種選育→蠶蛹選取→接種培養;人工固體培養，野生或培育種源選取→菌種分離、選育、復壯→試管母種→菌種擴繁→培養基制作滅菌→裝瓶（盆或袋）→接種→環境控制→采收;液體發酵培養，制作菌種斜面→搖瓶菌種培養→種子罐擴大培養→液體發酵罐深層發酵→離心分離。

2.2 不同培養方式的培養基制作 按照培養方式不同，可將培養基分為液體培養基與固體培養基2種。在人工控制的環境條件下，不同培養基成分對蛹蟲草的培養起著至關重要的作用。

2.2.1 固體培養基 我國生產者大都選用大米、小麥做原料制作固體培養基，原料簡便易得、成本低，培養出來的蛹蟲草品質好、蟲草素含量高。固體培養基的元素搭配有很多不同的配比，通過不同原料配比所得到的蟲草營養素含量與品質也大不相同。

張志瑾等以菌種初萌發時間、菌絲長速、菌絲長勢、菌絲長滿斜面所需時間為指標，篩選出最佳母種培養基配方為：20%馬鈴薯提取液中加入1%葡萄糖、1%蛋白胨、2%瓊脂、0.5%KH2PO4、0.3%MgSO4、10mg/L VB1，pH值5.8[7]。李春斌等通過對蛹蟲草子實體的人工培養研究發現，固體營養物以小米和高粱米的混合物為最佳，最佳碳、氮源為可溶性淀粉和蛋白胨，最佳pH范圍是5～6，VB1、2，4-D和無機元素K+、Mg2+、Ca2+對子實體的生長有促進作用[8]。高倩倩等以蟲草子座干重為研究指標，發現蛹蟲草工廠化生產的最佳培養基配方為90%小麥、10%豆粕，營養液為15g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、1g/L KH2PO4、1g/L MgSO4·7H2O、1g/L VB1、1g/L檸檬酸銨，合適的料液比為1.0∶1.6[9]。

2.2.2 液體培養基 液體培養基以各種不同的營養成分搭配，操作更安全可控、空間利用大、生產周期短、效益更高。韋會平等通過對比實驗發現，液體菌種栽培比常規栽培發菌時間縮短10d，現蕾出草時間縮短15d左右，且出草整齊，普遍能出2茬子實體，常規栽培的出草往往不整齊，用液體菌種栽培的產量及生物轉化率是常規栽培的4倍多，差異極為顯著[10]?，F多采用液體發酵罐發酵培養，所得產物的蟲草素更易提取，省去子實體提取工序。萬琴等以蟲草素含量為研究指標，發現最佳配方為：23g/L葡萄糖、6g/L酵母浸出粉、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.6g/L KH2PO4、0.01g/L VB1[11]。陳晉安等以菌絲體生長為研究指標，得出最適蛹蟲草發酵的液體培養基組分為：50g/L蔗糖、30g/L玉米漿、5g/L酵母膏、0.5g/L MgSO4·7H2 O、0.5g/L KH2PO4[12]。牛帥科等以菌體干重為研究指標，研究認為適合蛹蟲草菌的液體發酵最佳培養基為：53.36g/L葡萄糖、26.72g/L蛋白胨、20g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L KH2PO4[13]。范志微以菌絲體生長速度、菌絲體干重和菌落大小為指標進行初篩，以子實體干重、培養周期以及子實體形態、粗多糖含量為指標進行復篩，發現蛹蟲草菌株發酵培養基的最優水平組合為：3g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，2g/L MgSO4·7H2O1.5g/LKH2PO4[14]。以上實驗表明，對應不同的生產指標要求，蛹蟲草液體培養基的成分和含量的差異較大。

2.3 不同培養方式的接種技術 接種是蛹蟲草人工培養重要的技術環節之一，由于需要在無菌環境下進行，操作必須規范嚴謹。

2.3.1 蛹蟲草活體 蛹蟲草活體接種的方式多種多樣，安秀榮等比較研究了以下方法：（1）對活體蟲蛹進行液體菌種注射;（2）先將活體蛹扎孔放人廣口瓶，再倒入10mL液體菌種;（3）倒入10mL液體菌種至廣口瓶，再將活體蛹直接放入;（4）將已經培養成熟的子座接入活體蛹的體腔內;（5）將活體蛹扎孔后放人子座已長好的培養基上，使其自然感菌;（6）將活體蛹扎孔后放入已發滿菌絲的培養基上;（7）將斜面菌種接入活體蟲蛹體腔內。結果發現，菌液注射0.2～0.5mL入活體蛹的體腔內，出草較多，因菌絲侵入蟲體內部，利用蟲體內部營養，所形成的子實體健壯，商品率高。所以在生產中采用活體注射入體腔的方式最好[15]。

2.3.2 蛹蟲草人工固體培養 接種過程必須保證無雜菌污染，接種時根據環境條件和設施，選擇適宜的無菌接種方式。將注射器等接種器具放入沸水或高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20～30min，培養基提前進行高壓滅菌，溫度達124℃時保持1.5h左右，滅菌結束后鍋內，待溫度達60℃左右時取出培養基，冷卻凝固后接種。嚴格按照無菌接種操作將菌種用無菌水稀釋倒入無菌瓶，在超凈工作臺上用注射器吸取菌液，在酒精火焰燈附近戳破無菌膜接種在固體培養基上?；蝿庸腆w培養基，使菌液均勻遍布培養基表面，接入菌量不宜過少，放置于培養架上進行培養。

2.3.3 蛹蟲草液體發酵培養 提前將蛹蟲草菌接種于改良PDA培養基，在（21±1）℃光照環境下活化培養，待菌株蔓延至培養基邊緣時，保存于冰箱備用。在無菌接種間，于超凈工作臺上將活化的菌絲接種于已滅菌的改良PDA液體培養基，放于搖柜170r/min、（21±1）℃搖培4～5d，獲得少量種菌懸液，然后接種于液體發酵培養基，接種量在10%～15%，注入發酵罐進行分批發酵，罐壓0.05～0.07MPa，通風量為1∶0.05（V/V·min），攪拌速率200r/min較為適宜。

2.4 子實體培養及環境調控 子實體由蛹蟲草真菌生殖菌絲生長而成，頂端膨大呈棒狀，是蛹蟲草人工培養的最終產物，一般子實體生長至橘紅色便代表已經成熟可以采收。影響子實體生長的因素包括溫度、光照、濕度、晝夜溫差、空氣成分、碳氮比等。生產上一般將栽培瓶放置在培養架上培養，溫度控制在22～25℃避光培養。菌絲長滿瓶進入原基形成階段，此階段每天要保持12h左右光照，若光線不足可用日光燈替代，空氣濕度保持在65%～70%、溫度18～22℃、晝夜溫差3～5℃、光照強度100lx左右適宜原基分化，大約5d左右菌絲由白色轉變為橘黃色形成子實體，原基分化完成后子實體已成型進入子實體培養階段。蛹蟲草屬于低溫菌類，子實體與子座對生長溫度有著很高的敏感度，光照對人工培養子實體有效成分蟲草素、蟲草多糖等的合成具有重要影響，子座最適宜生長溫度為18～22℃，如果低于或高于這個溫度范圍，生長減慢，高于30℃會很快死亡，子實體生長適宜溫度為18～22℃，超過25℃則難以形成。王菊風認為，蛹蟲草生長發育的適宜溫度是17～25℃，子實體生長的最適溫度是22℃[16]，強光有利于蟲草多糖、胡蘿卜素等的提高，弱光有利于子實體產量、蟲草素等的提高，延長光照時間則有利于原基形成。子實體培養期間應將光照時間縮短至自然長度，保證白天有充足的散射光，晚上不補光，每天轉動不同瓶面以確保子實體受光均勻，大約15d即可采收第一批子實體。張金艷經過綜合研究認為，蛹蟲草培養適宜的光照條件為：白熾光、光照強度為200lx，每天光照時間分階段設置，原基形成階段24h/d、子實體生長階段16 h/d為最佳[17]。高曉梅等通過光質和光強對蛹蟲草子實體形成、生長的影響試驗認為光強：50～100lx弱光對原基分化、子實體誘導有促進作用，1000lx條件下子實體生長較好，橙黃光條件下子實體的質量和產量都有所提高[18]。綜上所述認為，子實體培養過程中的光照、溫度、空氣濕度是重點控制的3個要素，溫度保持在22℃左右、光照強度1000 lx左右、空氣濕度在65%～70%，適宜于蛹蟲草子實體的培養。

2.5 子實體采收及次級代謝產物蟲草素等的提取

2.5.1 子實體采收 在經過嚴格控制的環境條件下培養15d左右，子實體表面長度達到6～7cm，子囊膨大成熟，便可以采收第1批子實體。用工具小心將子實體基部采下，除去表面雜質和多余的水分。繼續培養一個周期可以收獲第2批子實體。將所采收的子實體用40～45℃烘干器烘干至含水量≤12%，分批保存。人工培養的蛹蟲草包含蟲草素、蟲草多糖等多種稀有營養元素，營養價值極高，若將其中營養物質提取出來并作藥用，或加工或開發保健品，將大幅度提高其附加值。

2.5.2 次級代謝產物蟲草素等的提取 雖然從子實體中提取所得蟲草素含量最多，但在實際生產過程中，為使經濟效益最大化，蛹蟲草的培養基殘渣中的蟲草素、蟲草多糖等有較大經濟價值的次級代謝產物也不容忽視，并且從副產物中提取也比從子實體中提取的成本更低、效益更高。因此，研究如何從培養基殘渣中提取蟲草素等成為了行業研究的熱點。韋會平等通過連續逆流提取、732陽離子交換樹脂柱層析和結晶3步法，對每一步的工藝參數進行了系統優化，用該優化的方法從大米培養基中提取蟲草素，產品的純度達98.0%以上，產率達66.0%以上[19]。車振明通過對蛹蟲草子實體及培養基的粉碎，采用石油醚脫脂、80～85℃水浴12h、調節等電點沉淀、732-NH4離子交換樹脂的分離和濃縮、4℃下低溫結晶方法，得到純度達81%的蟲草素晶體[20]。孫詩清從優化的蟲草素和蟲草多糖生產工藝出發，研究出同時提取蟲草素和蟲草多糖的工藝方法，同時，分別采用高效液相和苯酚-硫酸法對蟲草素和蟲草多糖進行含量測定，確定不同純化方法所得蟲草素蟲草多糖的含量差異，進一步確定分別使用陰離子樹脂和DEAE纖維素為最好的純化方法[21]。麻兵繼等用石油醚脫脂，殘渣干燥后以熱乙醇提取得浸膏，浸膏轉水溶后調節等電點，再用活性炭脫色，脫色后的溶液最后過732陽離子交換樹脂以NH3·H2O洗脫液洗脫，得到蟲草素純度約為80%，總得率約為1‰[22]。綜合上述研究，我們可以得出其基本的分離提取步驟：先用石油醚脫脂，再用離子交換樹脂進行初步分離，由于蟲草素呈弱堿性，所以應該選用強酸性陽離子樹脂進行分離，最后經過濃縮，在低溫下結晶，便可得到純度較高的蟲草素結晶產物。

3 展望

目前，蛹蟲草人工培養雖能規?；a，但仍存在一些問題，如菌種退化、次級代謝產物（殘留蟲草素培養基）利用率低等。（1）蛹蟲草人工培養普遍存在菌種退化的問題，即培養一定周期后蛹蟲草菌子實體不再生長，或生長不全。菌種退化最容易出現在大規模培養基固體培養，液體發酵培養等批次培養過程中。夏鳳娜等研究了蛹蟲草在5種保藏條件下菌絲活化的情況以及菌絲活化后的深層培養和固體培養長勢等發現，蛹蟲草最佳保藏溫度為（4±2）℃[23]，溫度可以影響菌種退化率，汪虹等對收集到的14株蛹蟲草正常菌株和退化菌種進行PCR鑒定發現，3株正常菌株為異核體，11株退化菌株僅僅含有MAT-HMG或者MAT-alpha交配型基因，判定為同核體[24]，通過預防核相改變防止菌種退化是解決問題的根本，在實際生產中可以采用減少傳代次數，改善培養基營養配比，優化菌種種源的保存環境、調節pH，及時復壯選育優質種源等方式降低菌種退化。（2）我國蛹蟲草人工固體培養過程中的殘余物質蟲草素等的提取工藝還并不完善，次級代謝產物利用率極低。因此，未來需要大力提升蛹蟲草次級代謝產物的提取工藝水平、降低提取成本，提高提取效率。

當前，我國的蛹蟲草人工培養仍以固體培養或蠶蛹活體培養為主要方式，然而蠶蛹或固體培養都存在成本高、經濟效益低等問題，在培養過程中對無菌以及生長環境要求苛刻，需要嚴格控制空氣溫度和空氣濕度，耗費大量的人力物力，蟲草素的提取成本高、效率低?；铙w人工培養一般在春季4—7月培養，受生物蟲體因素影響大。液體發酵培養的菌絲生長快、周期短、條件安全可控，污染較前2種方式更低，可通過發酵罐連續發酵，蟲草素等營養物質提取方便，能適應工業化連續生產。因此，未來蛹蟲草人工培養將以液體發酵培養為主要發展方向，逐步實現蛹蟲草的工業化、規范化生產。

參考文獻

[1]傅明，喬文濤，侯軍，等.蛹蟲草中抗HIV-1活性成分的研究[J].南開大學學報（自然科學版），2007，40（5）：91-95.

[2]江曉路，孫月.蛹蟲草活性成分的測定[J].食用菌學報，1999，6（1）：47-50.

[3]王艷華，徐國華，李劍梅，等.蛹蟲草高產優良菌株的選育[J].食用菌，2017，（2）：24-26.

[4]袁雪芬.優質蛹蟲草的快速選育方法[J].安徽農學通報，2012，18（7）：62-63.

[5]李光榮，文庭池，康冀川，等.蛹蟲草表型多態性對子實體產生及蟲草菌素的影響[J].微生物學通報，2011，38（3）：370-382.

[6]梁曼逸，谷桓生.蛹蟲草人工培育獲得成功[J].沈陽農業大學學報，1987，18（3）：103-104.

[7]張志瑾，毛寧，張愛霞，等.蛹蟲草母種培養基配方優化研究[J].天津農業科學，2013，19（10）：15-18.

[8]李春斌，佟曉冬，白靜，等.蛹蟲草子實體的人工培養研究[J].大連民族大學學報，2004，6（5）：29-31.

[9]高倩倩，張潔，石佳，等.蛹蟲草工廠化生產栽培基質優化[J].黑龍江農業科學，2018，（11）：97-110.

[10]韋會平，肖波.用液體菌種栽培蛹蟲草的效果觀察[J].食用菌，2004（2）：19.

[11]萬琴，丁海龍，劉興平，等.蛹蟲草液體培養優化研究[J].食品與發酵科技，2016，52（3）：46-51.

[12]陳晉安，黃浩，鄭忠輝，等.蛹蟲草液體發酵條件的研究[J].集美大學學報（自然科學版），2001，6（3）：219-223.

[13]牛帥科，楊自潔，李艷.蛹蟲草菌的液態培養基優化[J].食品與機械，2012，28（2）：202-205.

[14]范志微.蛹蟲草優良菌株的篩選及其營養特性的分析[D].哈爾濱：東北林業大學，2013.

[15]安秀明，孔怡，王明才，等.活蟲體人工培養泰山蛹蟲草技術試驗[J].食用菌，2007（1）：40-41.

[16]王菊鳳.蛹蟲草培養及其生理活性物質研究[D].長沙：中南林業科技大學，2006.

[17]張金艷.蛹蟲草人工培養技術及其主要有效成分調控的研究[D].重慶：西南大學，2010.

[18]高曉梅，陳月仍.光照對人工培養蛹蟲草子實體形成和生長的影響[J].廣東農業科學，2006（6）：31-32.

[19]韋會平，葉小利，張華英，等.從廢棄蛹蟲草大米培養基中高效提取純化蟲草素工藝條件研究[J].菌物學報，2009，28（2）：220-225.

[20]車振明.人工蛹蟲草子實體及大米培養基殘基中蟲草素的提取純化方法[J].食用菌，2004，26（4）：40-41.

[21]孫詩清.蛹蟲草培養基的綜合利用研究[D].西北大學，2005.

[22]麻兵繼，申進文，阮元.從人工蛹蟲草培養基殘基提取蟲草素的研究[J].中國藥師，2008，11（8）：937-938.

[23]夏鳳娜，胡惠萍，邵滿超，等.蛹蟲草菌種五種保藏條件的保藏效果對比試驗[J].食用菌，2010，32（5）：30-31.

[24]汪虹，魏靜，林楠，等.交配型基因作為分子標記鑒定蛹蟲草退化菌株的核相初步研究[J].食用菌學報，2010，17（4）：1-4.

（責編：張宏民）