帕立骨化醇和依那普利對ApoE基因缺陷小鼠的脂聯素表達和心臟的保護作用

王洪浩 王慧智 田倩 楊森 方沛鈺 代莉（通訊作者） 歐亞萍

（1 貴陽市第二人民醫院心內科 貴州 貴陽 550004）

（2 貴陽市第二人民醫院內分泌科 貴州 貴陽 550004）

帕立骨化醇是一種人工合成的具有生物活性的維生素D類似物，同維生素D一樣帕立骨化醇需要通過與維生素D受體（VDR）結合才能發揮相應的生理效應[1]。臨床研究顯示，帕立骨化醇對心血管疾病、免疫炎癥反應、腎臟疾病及腫瘤等都有一定的療效。ACEI抑制劑依那普利屬于腎素血管緊張素（RAS）系統，除了具有調節血壓的作用，還能夠改善因RAS活性升高引起的局部組織病理性損傷，Husain等[2]使用ApoE KO小鼠研究有關帕立骨化醇與依那普利聯用對動脈粥樣硬化小鼠損傷的藥理作用，發現兩藥合用能夠顯著逆轉小鼠主動脈炎性標志物COX2、TNF-α、MCP-1等的蛋白表達，研究結果說明帕立骨化醇與依那普利的聯合應用不僅能改善ApoE KO小鼠主動脈的炎性損傷，還有效抑制了氧化損傷，并且使用療效強于任何一種藥物的單獨作用。本文旨在通過動物實驗，研究維生素D受體激活劑及血管緊張素轉化酶抑制劑聯用對ApoE KO小鼠體內及心臟組織脂聯素表達、動脈粥樣硬化相關因素及炎癥因子水平的影響，是否能發揮抗動脈粥樣硬化及心臟保護作用，探索一種新的治療冠心病的治療靶點，從而為臨床治療提供新的理論依據。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 ApoE KO小鼠，體重（25.0±1.8），由貴州大學動物實驗中心提供并飼養，動物合格證號：SDXK（黔）2015-0003。飼養環境溫度25°左右，濕度約50%，保證動物自由飲食和進水，同時晝夜循環光照。40只ApoE KO小鼠隨機分為四組，使用帕立骨化醇及依那普利進行藥物干預的實驗治療方式，檢測維生素D受體激活劑及血管緊張素轉化酶抑制劑這兩種藥物對ApoE KO小鼠脂聯素表達、動脈粥樣硬化相關因素及炎癥因子的影響，探索一種新的治療冠心病的治療靶點。

1.1.2 實驗儀器和方法 全自動生化分析儀（日立7170s），臺式高速冷凍離心機（德國Hermle公司），PCR儀，電泳儀；帕立骨化醇購自雅培公司，依那普利購自揚子江藥業。脂聯素、COX-2、TNF-α試劑盒購自上海冠導生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將7周大的ApoE KO小鼠28只隨機分為四組。給予如下16周的處理：組1：ApoE陰性對照組（n=6，腹腔內注射 100μl 丙二醇 每周3次）；組2：ApoE- 帕立骨化醇組（n=8，200ng 腹腔內注射 每周3次）；組3：ApoE-依那普利組(n=8，30mg/kg 腹腔內注射 每日一次)；組4：ApoE-帕立骨化醇+依那普利組（n=6帕立骨化醇200ng 腹腔內注射 每周3次+依那普利30mg/kg 腹腔內注射 每日一次)；通過動物實驗，按分組飼養要求飼養動物，實驗結束后分離心臟組織，采集血樣樣本利用生化、免疫組化及病理等方法，觀察各組ApoE小鼠脂聯素水平、動脈粥樣硬化相關因素及炎癥因子（如Tch、COX-2、TNF-a等）對心臟的表達差異。

1.2.2 標本采集 四組ApoE小鼠經過16周喂養處理后抽取左心室動脈血，并將小鼠血液在8℃條件下4000r/min離心15分鐘，分離上層血清，-20°冰箱保存待測，采用全自動生化分析儀和PCR儀測定血清Tch、COX2、TNF-α值。

1.3 統計學分析

數據分析采用SPSS15.0軟件包進行分析，符合正態性的計量資料用（±s）表示，兩組以配對樣本t檢驗，計數資料用百分率（%）表示，予以χ2檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2.結果

2.1 各組小鼠死亡情況

至實驗結束前各組小鼠均未見死亡。

2.2 各組小鼠血清及心臟組織脂聯素、Tch、COX-2、TNF-α水平表達對比

與對照組相比組2-組4脂聯素水平均增高，具有統計學差異（P＜0.05），特別是組4脂聯素水平明顯增高，差異顯著（P＜0.01）；組2-組4Tch水平均明顯降低，具有統計學差異（P＜0.05）；組2-組4炎性標志物（COX-2、TNF-α）水平減低，具有統計學差異（P＜0.05），其中組4炎性標志物水平明顯降低，差異顯著（P＜0.01）。見表。

表 各組小鼠16周后血清Tch、COX-2、TNF-α水平對比（±s）

表 各組小鼠16周后血清Tch、COX-2、TNF-α水平對比（±s）

注：與給藥前比較，*P＜0.05；與對照組比較，#P＜0.01。

組別例數(n)脂聯素（ug/ml）Tch（mmol/L）COX-2（mg/L）TNF-α（ug/L）組1612.59±3.465.74±1.335.34±0.658.41±0.24組2814.46±3.25*4.53±2.06*1.75±0.23*3.67±0.08*組3813.83±2.78*3.96±2.45*5.53±0.61*2.39±0.22*組4617.46±4.74*#3.54±1.27*1.28±0.14*#0.16±0.02*#P-0.0000.0000.0000.000

3.討論

帕立骨化醇(paricalcitol)是由雅培公司(Abbott)研發的一種維生素D類似物，同維生素D一樣需要通過結合VDR而發揮相應的生理效應，帕立骨化醇首先被用于預防和治療繼發性甲狀旁腺功能亢進癥(SHPT)。隨著大量研究顯示，帕立骨化醇除了對SHPT，對其它如心血管疾病、免疫炎癥反應、腎臟疾病及腫瘤等都有一定的療效。體內如果缺乏維生素D，就會增加心血管疾病的發病率，如高血壓、缺血性心臟病和心力衰竭等，而帕立骨化醇能夠抑制RAS系統活性，起到降壓及有效改善左室重塑的作用。脂聯素是目前發現的唯一具有保護性的脂肪因子，而氧化應激是動脈粥樣硬化發生的重要機制之一，因此脂聯素在保護心肌、延緩冠心病進展等方面發揮了重要作用。Kyriazi等[3]研究發現脂聯素不僅可以終止 IL-6 和TNF -α介導的信號轉導通路，還能誘發巨噬細胞中抗炎基因的表達，因此脂聯素可通過復雜的抗炎作用來對抗動脈粥樣硬化，從而起到保護血管內皮功能的作用。既往研究發現，當帕立骨化醇和依那普利聯合使用時，不僅能顯著增加ApoE KO小鼠體內脂聯素的水平，還能有效預防大動脈內皮氧化損傷和炎癥的發生。我們的研究結果發現VDRA聯合ACEI治療能夠顯著增高ApoE KO小鼠血清及心臟組織中脂聯素水平，顯著降低Tch和COX2、TNF-α水平，這也與既往國內外的研究結論相符合。本研究初步闡明了VDAR與依那普利聯用，不僅能夠改善ApoE KO小鼠動脈炎性損傷、抑制氧化損傷，還能保護心肌抑制左室重塑，從而起到抗動脈粥樣硬化及心臟保護作用，為臨床治療提供了新的理論依據和治療思路，但本研究樣本量小，還需更多研究及臨床實驗加以證實。