基于響應面法優化白及原球莖液體培養基

王艷 陳勛 李燦 婁婷 周日寶

〔摘要〕 目的 采用響應面優化（Box-Behnken design， BBD） 法優選白及原球莖液體培養基，提高白及種子萌發形成原球莖的誘導率。方法 采用3水平4因素設計BBD實驗，在30 g/L的蔗糖溶液中添加大量元素（MS）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和玉米素（ZT）作為白及原球莖液體培養基，并通過響應面法優選4種添加物濃度配比。結果 BBD實驗模型設計成功可用于響應面結果優化，經響應面優化后，在1 mg/L MS、2 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA、0.07 mg/L ZT條件下，白及原球莖誘導率可達（93.13±0.34）%，與預測值95.38%差異無統計學意義（P>0.05）。白及原球莖直播種苗存活率良好，長出的葉片數、植株高度、莖長及莖寬均超過種子直播種苗的數值。結論 在基本液體培養基中合理配比4種天然添加物可提高白及原球莖誘導率，進而提高種子萌發率。

〔關鍵詞〕 白及;原球莖;響應面;BBD設計;誘導率

〔中圖分類號〕R282.2? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.009

白及Bletilla striata （Thunb.） Reichb.f.為蘭科白及屬多年生草本植物，以其假鱗莖入藥，為我國傳統中藥，具有補血、止血、消腫、收斂等多種功效[1]。白及同時作為一種景觀植物，花色艷麗，觀賞價值高，在我國多地均有栽培[2]。但其栽培存在繁殖周期長、繁殖效率低、耗種量大等不足，有待于進一步提升[3-4]。

無菌栽培技術的發展促進了中藥材栽培的發展[5-6]，采用無菌萌發技術應用于白及培養已取得較好效果，已成為今后白及繁殖的重要途徑之一[7-8]。白及的發育遵循蘭科植物基本發育規律，種子發育成完整植株需經歷種胚、原球莖、根狀莖、假鱗莖4個階段，其中以原球莖最為重要[9]。原球莖是蘭科種子萌發過程中的一種形態學構造，具有遺傳性狀穩定且代謝旺盛等特點，通過原球莖進行繼代培養可迅速獲得增殖小苗[10]。因此，如何提高原球莖誘導率已成為白及研究的重點及難點。

目前，在培養基中添加相關植物激素以促進植物種子萌發形成原球莖已成為研究熱潮[11-12]，但如何對培養基中天然添加物濃度進行合理配比仍有待于進一步研究。故本實驗以白及為栽培樣本，采用響應面優化（Box-Behnken design， BBD）大量元素（MS）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和玉米素（ZT）等添加物濃度進行優化研究，通過提高白及原球莖誘導率以促進白及種子萌發，旨在提高白及快速繁殖。

1 材料

1.1? 藥品與試劑

白及種子購于四川成都都江堰基地，經湖南中醫藥大學藥學院周日寶教授鑒定為白及Bletilla striata （Thunb.） Reichb.f.成熟期的蒴果。

所需試劑主要有硝酸鉀（AR，湘中地質實驗研究所）;75% 酒精（安徽安特食品股份有限公司）;升汞（AR，貴州省銅仁化學試劑廠）;無水氯化鈣、蔗糖、甘氨酸、鹽酸硫胺素、煙酸、肌醇、1-萘乙酸（NAA）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、玉米素溶液（ZT）均為國藥集團化學試劑有限公司生產。

1.2? 主要儀器

BSC生物安全柜（超凈工作臺）（蘇州市華宇凈化設備有限公司）;PYX-800Q-B人工氣候箱（科力儀器）;GB/T 23111分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;YXQ-LS-100G 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）;CX23奧林巴斯光學顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司）。

2 方法

2.1? 培養方法及條件

種子消毒：在超凈工作臺中，用鑷子打開白及果莢，取出種子放入多層紗布包好放入75%酒精中浸泡1 min，再放入用0.1% HgCl2消毒10 min，期間不停搖動，無菌水沖洗5～6次，放在無菌濾紙吸干表面水分。

白及種子液體培養基以MS為基礎培養基，將消毒滅菌后的白及種子在無菌環境下分別接種到所配制的不同液體培養基中，進行無菌培養。設4個變量分別是：MS、6-BA、NAA和ZT。每一個處理組均含有30 g/L蔗糖，培養條件為：pH5.8，室溫25 ℃，黑暗培養8 d，然后進行光照培養37 d，光照強度2 000 Lx，光照時間12 h/d，共培養45 d。

2.2? BBD實驗設計

以前期單因素預實驗結果為基礎，采用3水平4因素BBD實驗篩選白及原球莖誘導率最優組合。選取MS（A），6-BA（B）、NAA（C）和ZT（D）因素中影響最大的3個水平，分別以-1、0、1編碼，因素與水平設計見表1。

原球莖誘導率=原球莖個數/接種種子總數×100%。

2.3? 統計學方法

響應曲面模型和顯著性統計采用Design Expert 8.0.6軟件進行設計分析。計量數據用“x±s”表示，采用SPSS 21.0統計軟件進行方差分析。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用t檢驗，P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。模型的準確性及顯著性由F值、回歸系數r和失擬項決定。回歸系數R2越接近1，則模型越可靠，預測系數和調整系數越高，模型越可靠。

3 結果

3.1? 統計分析和模型擬合

BBD實驗數據如表2所示。根據表2的數據分析得出BBD模型回歸方程為：

Y=-8.59+60.70×A-0.47×B+39.79×C+1 760.63×D+16.76×A×B-19.04×A×C-327.99×A×D-5.38×B×C-31.73×B×D-169.87×C×D-26.48×A2-2.12×B2-5.45×C2-9 809.07×D2，原球莖誘導率。

由表3可知，模型回歸系數R2=0.989 1，P<0.01，說明該模型回歸極為顯著，可用于白及原球莖誘導率的試驗設計。根據顯著性標準，一次項A、B、C、D，交互項AB、AC、AD、BC、CD以及二次項A2、C2、D2對白及原球莖誘導率的影響均具有顯著性（P<0.01）。方程的失擬項P值為0.14（P>0.05），表明其對試驗結果的影響不顯著，說明模型良好;Radj2=0.989 1可解釋本模型中98.91%響應值的變化;Rpred2=0.942 2，Radj2=0.989 1，二者差異在合理范圍內（|Radj2-Rpred2|<0.2），說明該模型具有較好的回歸性。精密度為32.9>4進一步表明本模型設計合理[13]。

3.2? RSM分析

響應面三維圖和等高線圖不僅可以解釋自變量之間的相互作用，也可反映變量間的相互作用。通過觀察曲面的傾斜度確定兩者對響應值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說明兩者交互作用越顯著。A、B、C和D對白及原球莖誘導率的影響，4因素之間的交互曲面均具有較大的傾斜度，說明兩兩因素之間的交互作用對白及原球莖誘導率的影響較大。

3.3? 驗證試驗

3.3.1? 最優液體培養基培養白及無菌種子? 根據擬合方程和方差分析結果可知白及原球莖誘導率的最優條件為：A=1 mg/L、B=2 mg/L、C=0.5 mg/L、D=0.07 mg/L。在此條件下，白及原球莖誘導率達到最大預測值95.38%。為證實預測值的準確性，在最優條件下進行驗證實驗，得到較高的白及原球莖誘導率，其實測值為（93.13±0.34）%，與預測值95.38%相比差異無統計學意義（P>0.05），白及種子形成原球莖狀況進一步可說明BBD模型預測良好，該配比可用于白及種子萌發形成原球莖的液體培養基。

3.3.2? 原球莖煉苗馴化直播與種子直播種苗長勢對比? 白及種子液體培養60 d后，開瓶取出原球莖用自來水沖洗干凈培養基，放入清水中煉苗馴化處理3 d后直接播種在基質為培養土（椰糠等）∶珍珠巖∶蛭石配比為10∶2∶1的苗床上。播種完后用保鮮膜覆蓋穴盤，控制大棚內的各項環境因素，達到白及最適宜成苗的條件，并保持大棚內通風，定期澆水，按時進行田間追肥管理。在白及種子接種在液體培養基的同一天將白及種子直接進行同等條件直播培養。兩種方式均培養10個月后種苗長勢。

兩種方式培養栽種10個月后，采用隨機5點取樣調查法，每點隨機取10株白及苗，每組各取50株進行觀測，觀測指標有真葉片數、株高、莖長、莖寬。測量單株各項指標的方差值見表4。白及原球莖播種長出的葉片數、植株高度、莖長及莖寬均超過種子直播種苗的數值。

4 結論

白及在野生狀態或人工栽培條件下繁殖速度較慢，繁殖系數低。組培技術是白及種子萌發非常有效的一項手段[14]，本研究主要從MS濃度、6-BA濃度、NAA濃度和ZT濃度4個因素著手，考察其對白及種子萌發形成原球莖的影響，并篩選最佳條件。液體培養白及種子萌發形成原球莖受許多因素的影響，不同培養基配方對白及種子萌發形成原球莖的誘導率的影響不同。 本研究采用響應面法對現有的白及種子萌發形成原球莖的液體培養基培養條件優化，為更好優選出白及原球莖提供技術支撐。

同時，在實驗中發現白及的種子細小如灰塵，在液體培養時很難精確計算白及種子的接種數量。故本研究在前人研究的基礎上，按照白及種子相同的懸浮程度，每種處理取相同計量的白及種子懸浮液進行定量接種，基本保證了每組實驗中白及種子總數的一致性，最大限度降低了因接種密度不同所導致的實驗的誤差。在現有的報道中采用液體培養白及種子及原球莖的研究逐漸增多，本研究通過液體培養白及種子及原球莖，以求克服固體培養的弊端，在培養過程中，種子和原球莖能充分接觸營養物質，加快了種子萌發和原球莖生長發育速度，最終提高了白及種子萌發率和原球莖誘導率，可為快速生產白及無菌苗提供有效的技術參數，為推動白及種苗規模化生產奠定堅實基礎。此外，后期在原球莖需要轉接培養時，將其移栽在自然界中，既提高了發芽率，而且降低了生產成本，能在短時間內獲得大量的白及種苗，滿足大面積、規模化育苗的需要，具有生產與經濟上的雙重意義。

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