小球藻固定CO2能力與油脂積累條件研究

梁梁 杜風光 陳嘉山 劉秀花 梁峰

摘 要：小球藻生長速率快、易于培養且能進行光合作用，可作為生物法固碳的優良材料。而CO2作為全球變暖的元兇，如何減少大氣中CO2含量已是當今熱門話題。但目前對小球藻去除CO2的研究中，大規模培養的較少。因此，本實驗以120L玻璃封閉的自制大容器為培養器，以HSM1添加植物激素6-BA 0.5mg/L為培養基，培養時持續通入CO2和空氣，通氣量為1L/min，CO2的濃度為6.56%，并進行光照、水循環等，對小球藻進行大規模培養。結果表明：小球藻對CO2的去除率最高達24.09%，鮮重為3.624g/L，產油能力為0.14g/L。

關鍵詞：小球藻;大規模培養;生物固碳;生物燃料

中圖分類號：Q945 文獻標識碼：A 文章編號：1003-5168（2019）17-0131-05

Abstract： Chlorella has a high growth rate， is easy to cultivate and can perform photosynthesis， and can be used as an excellent material for biological carbon fixation. CO2， as a greenhouse gas， is the main culprit of global warming. How to reduce CO2 content in the atmosphere is a hot topic today. In the current study of CO2 removal by Chlorella， large-scale cultures are less common. Therefore， in this experiment， a large-scale culture of Chlorella vulgaris was carried out in a 120L glass-enclosed self-made container with HSM1 and phytohormone 6-BA 0.5mg/L as the medium. During the culture， CO2 and air were continuously injected with a ventilation rate of 1L/min and a concentration of CO2 of 6.56%. Light and water circulation were also carried out to culture Chlorella vulgaris on a large scale. The results showed that the highest CO2 removal rate of Chlorella was 24.09%， fresh weight was 3.624g/L， and oil production capacity was 0.14g/L.

Keywords： Chlorella;large-scale culture;biological carbon fixation;biofuel

小球藻（Chlorella）為綠藻門小球藻屬普生性單細胞綠藻，是一種球形單細胞淡水藻類，直徑3～8μm，內有一個周生、杯狀或片狀的色素體，是一種高效的光合植物。微藻固碳已經成為消減溫室氣體排放的新的研究熱點[1]。自養型藻類主要依靠CO2和光能生長，在光合作用過程中，藻類吸收CO2，并將其轉化為糖、蛋白質、油脂等生物質能。藻類對光量子（太陽能）的吸收轉化率可達8%～10%，而一般農作物的光能轉化率只有1%～3%[2]。每生產100t微藻，約可吸收利用470t碳元素，可轉化掉185t CO2。因此，藻類養殖是控制和減少大氣中CO2的一種有效途徑[3]。在300mL的小培養容器中，對CO2的去除率為27.69%，固碳量達到256.86mg/（L·h）[4]，而小球藻去除CO2的研究必將邁向大容器、大規模培養。小容器培養與大容器培養中存在許多微小且令人意想不到的問題，這些問題也是在實驗的深入研究中所必須要面臨的。

對于以消減大氣中CO2為目的大規模微藻培養，其主要利用微藻生長速度快、易于培養且能達到較高密度培養的特性來進行本次實驗。本實驗選用實驗室分離純化的一株小球藻，生長迅速，抗逆性強，且能在雜藻及雜菌中優勢生長，可作為CO2減排藻株。以HSM1添加6-BA為其培養基，并在培養過程中，對光照強度、通氣量、容器內水循環等進行控制。本文主要分析大容器培養中，每個時期的CO2去除率，并觀察其變化，分析變化的內外原因。同時，觀察并測量每個時期的生物量，最后將其回收并測量藻內含油量，以為后續生物精煉方向的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株為小球藻，來自于生物精煉河南省工程實驗室。本實驗的基本培養基為HSM1培養基，其成分為：NH4Cl 0.500g/L，K2HPO4 1.440g/L，KH2PO4 0.720g/L，MgSO4·7H2O 0.020g/L，CH3COONa 2.000g/L，CaCl2·2H2O 0.010g/L，Trace 1mL。其他涉及培養基有以下三種。

BBM培養基：NaNO3 0.250g/L，KH2PO4 0.175g/L，K2HPO4 0.075g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，NaCl 0.025g/L，Trace 1mL。

DS培養基：NaNO3 0.300g/L，CO（NH2）2 0.150g/L，K2HPO4·3H2O 0.050g/L，FeC6H5O7 0.006g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，Trace 1mL。

SE培養基：NaNO3 0.250g/L，K2HPO4·3H2O 0.075g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，KH2PO4 0.180g/L，NaCl 0.025g/L，FeCl3·6H2O 0.010g/L，Fe-EDTA 1mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 CO2發生器的制作。取兩個2L的雪碧空瓶，并貼上A、B標簽。A瓶裝200g檸檬酸加600mL水，B瓶裝200g小蘇打加300mL水，搖勻待用。然后取雙出口瓶蓋兩個，并貼上A、B標簽。A蓋頂部一個口接壓力表，另一個口連接B蓋，下部接有通到瓶底的管子;B蓋一個口連接A蓋，其接口下部接有連接斜三角的管子（使其內液體單向流動，即A瓶液體能進入B瓶，B瓶液體不能進入A瓶，且B瓶的氣體能進入A瓶），另一個口為出氣口，其上接有調節出氣量的閥門。

接著蓋上瓶蓋，擠壓A瓶，使其內檸檬酸進入B瓶與小蘇打反應;松開A瓶，B瓶氣體進入A瓶，所以兩瓶氣壓相等。重復擠壓幾次后，隨著小蘇打與檸檬酸反應，內部氣壓升高，以致擠壓不動時，打開出氣口5s左右，使B瓶氣壓降低，A瓶的檸檬酸就會再次進入B瓶，關緊出氣口。搖晃B瓶，使其產生更多CO2，待壓力表上壓力為1.5左右時，出氣口接上通往培養器內的管子即可。為了保證安全，在壓力表處接上自動泄壓閥，也可手動泄壓，防止瓶內壓力過高。

1.2.2 培養裝置的制作。光照：用8條LDE長條燈帶環繞在玻璃培養器周圍，頂部裝上吸頂燈環形替換光源。測得內部光照強度大約為3 000lx。循環：玻璃培養器內部裝上兩個多功能潛水泵，提供內部的水循環，且保證一定的攪拌效果，防止過多的小球藻沉淀。通氣：外部裝上超靜音增氧泵和CO2發生器，通過橡膠管接入培養器內;每根橡膠管裝上止逆閥，防止內部水倒流;培養器內的橡膠管末端接上空氣細化器，使氣體均勻進入培養器。電源的接通：以上儀器均接于智能控制插座上，可自動控制以上儀器開啟和關閉的時間。氣密性檢查：開啟增氧泵，同時集氣口接上集氣袋，觀察集氣袋是否有氣體進入，正常進入即制作完成。

1.2.3 培養基的選擇及改良。用250mL的三角瓶對本實驗室小球藻進行培養基的選擇及改良實驗。本實驗用BBM、DS、SE、HSM1四種培養基培養小球藻，對其生長情況及油脂積累情況進行比較，選出最優。同時，用最優培養基添加不同的植物激素2，4-D、6-BA 0.5mg/L，對其生長情況及油脂積累情況進行比較，選出最優作為大容器培養的培養基。

1.2.4 菌種的活化。配制HSM1固體培養基20mL，然后和事先包扎好的10個平板一起放入滅菌鍋滅菌。滅過菌之后，在超凈工作臺中開始倒完平板，待平板凝固后拿出斜面保存著的菌種，進行四區劃線。最后，將劃好線的平板放入培養箱內培養4～5d。

1.2.5 種子液的配制。配制好HSM1培養基后，對其進行滅菌。滅完菌，待冷卻后，拿出之前活化好的平板，在超凈工作臺中，挑取單菌落接入錐形瓶里的培養基中。將接好的種子液進行光照培養4～5d。

1.2.6 計數接種。對培養了5d的種子液進行計數，并通過計算得出大約接種子液100mL，使得玻璃培養器中的含藻量為105個/mL。

1.2.7 氣體的測量。用氣體收集袋收集培養器內1min所排出的氣體，再利用排水法得出氣體的體積。CO2濃度的測量：用收集袋收集培養器內的氣體，再用便攜紅外氣體分析儀測量收集袋中氣體的CO2濃度。根據氣體流量和通入氣體與流出氣體中CO2的濃度變化算出小球藻對CO2的去除量和去除率[5]。

1.2.8 生物量的測定。濁度法：從玻璃培養器中取小球藻培養液，合理稀釋后在680nm下測定其光密度值，以OD680來衡量小球藻的相對生長量。

鮮重法：在玻璃培養器充分攪拌后，取100mL培養液，8 000r/min離心后將上清液倒掉，并將離心管倒置于報紙上，使其水分充分流失，稱重。

1.2.9 回收及含油量的測定。將衰亡期的培養液進行沉淀、離心回收，并取10g的鮮菌于離心管中，加入6mol/L鹽酸6～8mL，用玻璃棒攪拌均勻，超聲波30min后放入沸水浴中水浴1d，取出放到冰中冷卻后，加入95%乙醇10mL，用力搖勻，置于冰浴中10min。向離心管中加入5mL石油醚（30～60），5mL乙醚搖勻，4 800r/min，離心4min，小心用吸管吸取醚層液，放入已知重量的試管中（重量記為[m1]）。再加入3ml石油醚（30～60），3mL乙醚搖勻，4 800r/min，離心4min，小心用吸管吸取醚層液，放入同個試管中。在烘箱中由低到高逐漸升溫（不要暴沸），至85℃烘箱中干燥1h，取出冷卻稱重，直到達到恒重，重量記為[m2]，既得小球藻油脂重（g）為[m=m2-m1]，則可算得鮮菌的含油量。

2 結果分析

2.1 不同培養基對小球藻生長和油脂積累的影響

在培養小球藻的過程中，培養基是否合適至關重要。因此，在大規模培養之前，要對培養小球藻的培養基進行選擇優化，選出最優培養基，并將其改良成為適合本實驗的培養基，然后再開始進行實驗。小球藻L4在4種培養基BBM、DS、SE、HSM1中培養，培養10d后小球藻的生長情況如圖1所示。圖1中OD680為原液稀釋10倍的數值。從圖1可以看出，以HSM1為培養基能使小球藻迅速生長，且具有較大的生物量。這可能與HSM1含有較大量的NH4Cl和CH3COONa有關，NH4Cl為小球藻提供充足的氮源，而CH3COONa具有緩沖作用，防止培養基過酸而導致藻細胞大量死亡。

小球藻L4在4種培養基BBM、DS、SE、HSM1中培養，培養10d后小球藻的油脂積累情況如圖2所示。從圖2可以看出，以HSM1為培養基收獲的總油脂最多，這與其生物量大有關。因此，本實驗室保藏的小球藻適合生長于HSM1培養基中。該培養基能使小球藻在短時間內快速生長，符合培養小球藻去除CO2的實驗要求，并能在后期提供生物精煉方向的研究。在以下所有實驗中均以HSM1為基礎培養基。

2.2 不同植物激素對小球藻生長和油脂積累的影響

小球藻L4以HSM1培養基不加植物激素作為對照，添加植物激素6-BA、2，4-D培養10d，以100mL為培養單位的生長和油脂積累情況如表1所示。

從表1可以看出，在添加2，4-D的培養基中，小球藻的鮮菌重最高，但含油量低;而在添加6-BA的培養基中，雖然鮮菌重比添加2，4-D的培養基低，但含油量高。這主要是因為生物柴油是最常用的生物燃料之一，被公認為理想的可再生能源，因而也被看作為未來主要的能源來源。考慮到后期生物柴油方向的研究，選用HSM1添加植物激素6-BA為大容器培養的培養基。

2.3 大容器培養中小球藻的生物量變化

在以HSM1添加植物激素6-BA 0.5mg/L為培養基，培養時持續通入CO2和空氣，通氣量為1L/min，CO2的濃度為6.56%，光照強度為3 000lx的大容器培養中，小球藻受多種因素的影響，因此，和錐形瓶培養的結果會有所不同。大容器培養中小球藻的生長情況如圖3所示。

圖3中OD680為原液稀釋10倍的數值。從圖3可以看出，其延滯期比錐形瓶培養長了將近1d。因為通入CO2的原因，對數生長期生長情況優于錐形瓶培養。但是，在第6天提前進入了穩定期且OD680處于較低的狀態，這可能與內部水循環不充分有關，導致藻體沉淀以及生長不良。

2.4 大容器培養中小球藻對CO2的去除

小球藻在生長過程中會進行光合作用，從而吸收CO2產生O2，達到去除CO2的目的。在120L的大容器培養中，在優化的培養基中通入含6.56% CO2的空氣，通氣量為1L/min，觀察小球藻對CO2的去除情況，結果如圖4所示。

圖4上是大容器中CO2濃度的變化情況，圖4下是CO2去除率的變化情況。從圖4可以看出，小球藻在延滯期及對數生長前期吸收的CO2小于放出的CO2，之后對CO2的去除與生長具有一定的相關性。在此培養器中，有一段時間會有陽光直射，內部溫度可能會升高，使小球藻的呼吸作用加強。小球藻去除CO2的量最終會反映到生物量上來。隨著生物量的增加，顏色的加深，CO2的去除量及去除率逐漸與生長體現出相關性，培養8d時，去除率達到最高24.09%。最后，隨著小球藻生長速率減慢，對CO2的去除率逐漸降低。

2.5 大容器培養中小球藻的回收及含油量

因為小球藻具有多方面的價值，因而被廣泛應用于美容、醫療保健、生物精煉等行業。在大容器培養中，小球藻的生物量達到一定程度且穩定后，可對其進行回收利用，進行其他方面的檢測，從而充分體現小球藻的價值。培養10d，大容器中小球藻的生長已達到相對穩定。生長情況如圖5所示。

此時，生物量已達到穩定水平。但是，由于光線原因看起來會是不均勻的，后期將對光照裝置進行改良。

回收的方法是先關掉所有設備，使其沉淀2d，去除上清，留取約20L，取出用8 000r/min離心。此收集法獲得約200g鮮重，藻體含油量0.14g/L。小球藻藻體油滴的顯微拍照如圖6所示。

在圖（b）中，紅色為葉綠素，黃色為生物柴油。可見，大容器培養中小球藻的油脂較為明顯，可進一步改進提取油脂的方法。

3 討論

小球藻的生長繁殖快、抗逆性強、光合作用速率高、易于調控，適合用于生物工程技術方面的研究;同時，小球藻藻體具有很高的利用價值，具有較高的工業化潛力。因此，小球藻對CO2的固定有望成為一種可行性和經濟價值較高的CO2固定方法。

小球藻除了可應用于CO2的固定外，因營養豐富，細胞壁極薄，易于消化吸收，在水產養殖方面也具有重要的經濟價值;同時，小球藻的油脂含量高，微藻生物柴油是具有廣泛發展前景的生物柴油;在污水處理的研究中也有較大的進展等。

本文的研究僅僅是初步探索大規模培養小球藻所面臨的一些問題，而要真正深入探究及解決所帶來的問題，還需要迎接巨大的挑戰。

參考文獻：

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