苗藥小血藤對缺血性腦卒中大鼠的作用研究

王勝 龔毅 袁青青 劉曉龍 錢海兵

[摘要]目的研究苗藥小血藤對缺血性腦卒中大鼠的治療作用，并初步探討其可能的作用機制。方法用改良線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞（middlc cerebral artery occlusion，MCAO）模型。將造模成功的大鼠隨機分為假手術組、模型組、陽性組、苗藥小血藤高、中、低劑量組（3.75、1.875、0.9375g/kg），給予相應藥物1次/d灌胃給藥，連續7d。TTC染色觀察腦梗死面積;試劑盒檢測血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量;HE染色觀察腦組織病理改變。結果與模型組比較，小血藤水煎液各劑量組腦梗死面積明顯減少（P<0.05），大鼠腦組織勻漿中所含SOD活性顯著提高（P<0.05）;MDA含量顯著降低（P<0.05）;HE染色發現，小血藤水煎液各劑量組可一定程度上改善MCAO大鼠海馬區病理損傷。結論小血藤水煎液對MCAO導致的腦缺血大鼠可以減少梗死面積，促進其神經功能恢復，對缺血造成的損傷具有一定的保護作用，其機制可能與小血藤抗氧化應激損傷有關。

[關鍵詞]小血藤;缺血性腦卒中;超氧化物歧化酶;丙二醛

[中圖分類號]R255.2[文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.009

苗藥小血藤，為茜草科（Rubiaceae）茜草屬RubiaLinn，植物茜草Rubia cordifolia L的根，其主要功效為涼血止血，活血化瘀。小血藤在苗族地區被廣泛運用于體虛血少患者，治月經不調、鼻腔出血以及痔瘡等。前期藥理學研究表明，其具有保護神經、抗炎免疫、解聚血小板聚集等作用，所含茜草多糖具有延緩腦細胞衰老的作用，可通過上調Bel-2蛋白的表達，保護線粒體避免cyt C的釋出，提高線粒體Ca²⁺緩沖含量，從而達到抑制腦細胞凋亡的作用。本研究擬觀察小血藤對缺血腦損傷大鼠的保護作用，并初步探討其可能的機制，以期為后續進行小血藤抗腦缺血藥物的研究提供藥理學研究基礎。

1材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，購于長沙市天勤生物技術有限公司，生產許可證號SCXK（湘）2014-0011。飼養室溫20-25℃，濕度50%-70%，實驗動物術前1周進行適應性飼養，體質量（270±20）g。

1.2藥物

苗藥小血藤由貴州中醫藥大學藥理教研室提供（水煎濃縮液相當于生藥材1s/mL，4℃保存備用）;尼莫地平片，亞寶藥業集團股份有限公司（批號20181024）。

1.3 試劑

水合氯醛，天津市科密歐化學試劑有限公司（批號20180627）;HE染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司（批號20180820）;TTC染劑，北京索萊寶科技有限公司（批號10110031）;MDA測定試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號20181226）;SOD測定試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號20181220）。

1.4 儀器

酶標儀（北京新風機電技術公司）：組織包埋機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）;組織切片機（萊卡顯微系統（上海）貿易公司）;電子天平（北京艾科勒有限公司）;隔水式電熱恒溫箱（蘇州威爾實驗用品有限公司）;醫用離心機（江蘇新康醫療器械有限公司）;移液器（德國Eppendorf公司）。

2方法

2.1 造模及造模成功判定

參照Longa改良線栓法制備大鼠右側永久性大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）動物實驗模型。造模后24h，采用盲法進行神經功能評分（參照Bederson和Longa等5級4分的評分篩選法）。1-3分的大鼠即造模成功。將得0分和4分者剔除。

0分：無神經功能缺損，提起鼠尾懸空時兩前肢向地面伸直：1分：輕微神經功能缺損，提起鼠尾懸空時手術對側前肢屈曲，肩內收，前臂伸直;2分：中度神經功能缺損，向病灶對側轉圈的現象：3分：重度神經功能缺損，向手術對側傾倒，無法行走;4分：無自主活動伴意識障礙。

2.2 分組及給藥方法

將造模成功的MCAO大鼠隨機分為假手術組，模型組，陽性組，苗藥小血藤高、中、低劑量組，每組10只：術后24h，每組大鼠開始給予相應藥物干預，1次/d，灌胃給藥，連續7d：小血藤水煎液高、中、低劑量組按3.75、1.875、0.9375g（kg·d）灌胃（分別相當于人臨床擬用量的15倍、7.5倍、3.75倍）：陽性組給予尼莫地平片水溶液，15mg（kg·d）灌胃（相當于人臨床擬用量的7.5倍）：假手術組與模型組同體積生理鹽水灌胃。

2.3 指標檢測

2.3.1 血清SOD、MDA測定 取材前所有大鼠禁食不禁水12h，并于末次給藥2h后稱體質量記錄，大鼠仰位固定，4%水合氯醛（0.75mL/100g）腹腔注射麻醉;腹主動脈取血，靜置30min后，分離出血清（3000r/min，15min），按試劑盒說明書測定血清SOD活性與MDA含量。

2.3.2TTC染色測定腦梗死面積 腹主動脈取血后，迅速斷頭，自大腦縱裂將腦剪開，放置于冰盤上取出大腦，立即放人-20℃低溫冰箱冷凍30min，剔除掉嗅球和小腦，于局灶缺血的中部做2mm冠狀切片，每只大鼠采集腦片5-6片，切好腦組織在TTC溶液中浸沒染色，37℃恒溫培養箱避光染色30min，每隔15min翻面1次，染色后，用4%多聚甲醛溶液將其固定。正常腦組織染色呈深紅色，梗死灶呈蒼白色。觀察并拍照記錄，用Image-Pro Plus軟件統計腦梗死面積比例。

2.3.3 腦組織病理形態觀察 將固定于4%多聚甲醛中的大鼠腦組織取出，通過常規脫水、石蠟包埋切片、HE染色、封片，置于光學顯微鏡下觀察腦組織形態變化。

2.4統計學方法

實驗數據計量資料均以“x±s”表示，采用SPSS21.0統計軟件進行單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間比較方差齊時用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnetts T3檢驗，當P<0.05時，差異有統計學意義。

3結果

3.1 小血藤對大鼠血清SOD、MDA含量的影響

與假手術組比較，模型組SOD含量明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，給藥各組大鼠血清的SOD活力明顯上升（P<0.05）。與假手術組比較，模型組MDA含量明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠血清MDA含量明顯下降（P<0.05）。結果見表1。

3.2 小血藤對腦缺血后大鼠腦梗死面積的影響

非缺血損傷腦組織TFC染色呈紅色，缺血區域腦組織TTC染色呈白色。詳見圖1。缺血面積統計表明，模型組大鼠腦組織出現明顯手術后梗死。與模型組相比較，各給藥組大鼠腦組織梗死面積顯著減少（P<0.05）。詳見表2。

3.3 小血藤對腦缺血后大鼠腦組織病理形態改變的影響

大鼠腦組織HE染色觀察，光鏡下觀察各組大鼠海馬錐體細胞的病理改變情況。結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠海馬腦組織皮質較薄，細胞數量較少，結構欠清晰，局灶性細胞水腫溶解，神經元細胞染色深。與模型組比較，小血藤水煎液各劑量組和陽性組大鼠海馬區損傷減輕，細胞數量較多，排列較為整齊。詳見圖2。

4討論

腦卒中又稱中風，是一種突發的腦血管疾病，其中缺血性腦卒中約占全部腦卒中的80%左右，主要是由于大腦血栓的形成或栓塞引起急性局部大腦供血不足導致，同時大腦有限的代償能力不足以彌補血液減少或中止時大腦儲存的能量衰竭引起的腦組織缺血性損傷。病理損傷可分為缺血中心區和缺血半暗帶兩類，前者腦細胞往往在缺血后不可逆壞死，后者則大腦側支循環損傷較輕，其中由葡萄糖的代謝功能障礙產生的級聯反應損傷是缺血半暗帶產生的主要因素。

氧化應激被認為是腦卒中早期重要的損傷機制，缺血時活性氧的增加通過耗竭內源性的抗氧化物質，誘發氧化應激反應可引起細胞膜、脂質、蛋白質和DNA的損傷，H₂O₂，損傷細胞膜影響細胞離子通道的通透性，增加鈣離子內流是增加氧化損傷的因素之一。SOD作為生物體內非常重要的抗氧化酶一種蛋白酶，SOD活性的高低反映機體清除氧自由基的能力，可減少ROS對細胞膜的損傷，降低說明體內抗氧化能力不足，細胞將產生應激性反應從而引起氧化應激損傷。可以催化超氧化物自由基歧化，清除自由基，發揮抗氧化作用，也是氧化損傷中生物體內的主要防御機制。MDA是機體內細胞膜脂質過氧化的產物，其在體內的含量在一定程度上表明過氧化應激造成的損害程度。有研究表明尼莫地平可抑制H₂O₂誘導的鈣超載損傷、降低血管對鈣的敏感性、抑制H₂O₂對血管的直接收縮，防止H₂O₂對血管的氧化應激性損傷;明顯降低腦血管組織勻漿中的MDA含量，增強SOD等活性，具有一定的抗氧化保護腦損傷作用。中藥黃芪、人參等可改善腦組織代謝、抗氧化應激，減輕腦組織損傷。本研究結果顯示，與模型組相比，小血藤不同劑量組大腦組織的SOD活力明顯上升（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05），表明小血藤可以減輕因缺血而導致的氧化應激損傷，具有一定的神經保護作用。

缺血后腦梗死面積直接反映了損傷程度，因此對腦缺血動物模型進行腦組織梗死面積的測定對于評價腦缺血損傷程度具有重要意義。本實驗研究結果顯示，小血藤對腦缺血導致的腦梗死面積具有明顯的減輕作用。HE染色，在光鏡下觀察各組大鼠海馬錐體細胞的病理改變情況。結果顯示，與模型組比較，小血藤水煎液各劑量組和陽性組大鼠海馬病變程度總體較輕，提示小血藤水煎液能改善MCAO大鼠腦組織海馬損傷。

綜上表明，小血藤水煎液可明顯減少MCAO大鼠腦缺血組織的范圍和界限，在一定程度上具有改善MCAO大鼠海馬損傷的功能，其機制可能與通過調節氧化應激的相應指標，提高機體抗氧化水平，增強修復能力有關，其他方面的機制是否與鈣離子通道有關等，尚待深入研究。