降糖袋泡茶總多糖的含量測定研究

任凌燕 ，陳 楠 ，徐 剛

（1.重慶科技學院安全工程學院，重慶 401331；2.工業發酵微生物重慶市重點實驗室，重慶 401331）

目前，糖尿病嚴重威脅著人類的健康。2017年國際糖尿病聯盟公布目前全球共有4.25億成人糖尿病患者，中國成人糖尿病患者人數高達1.14億，位居世界第一，占總數的1/4以上[1]。而中國糖尿病的患病率2013年達到10.9%，僅次于美國（13%）[2]。隨著人們對中草藥多糖研究的深入，利用其開發制作安全經濟、具有降血糖保健功能的天然食品引起廣大學者的持續關注。

袋泡茶因其具有沖泡快速方便、清潔衛生、用量標準的特點，可橫跨茶飲料、保健品、藥茶三大行業。其中以茶為原料，傳統中草藥為主要成分的保健袋泡茶正適應了現代人們快節奏生活工作和保健養生的需要。降糖袋泡茶以綠茶為基礎，與生黃芪、玉米須、萆薢、知母、荷葉、桑葉、葛根等多味中草藥混合組成，在臨床應用中發現其對糖尿病患者日常控制血糖具有良好效果。我們通過前期藥理研究已發現，該降糖袋泡茶對實驗性糖尿病大鼠具有明顯的降糖作用[3]。據相關文獻報道，其袋泡茶中黃芪多糖[4]、玉米須多糖[5]、知母多糖[6]、桑葉多糖[7]、葛根多糖[8]、綠茶茶多糖[9]等均具有不同程度的降血糖作用。因此，研究降糖袋泡茶總多糖含量水平的高低，可為降糖袋泡茶的后續開發和質量控制提高一定的參考依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 儀器：紫外分光光度計（UV-1100上海美譜達儀器有限公司）、13S223S分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限責任公司）、HH-6數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）等。

1.1.2 實驗試劑與材料：降糖袋泡茶（生黃芪、玉米須、荷葉、葛根等中藥飲片購自重慶桐君閣飲片有限責任公司，打粉后于綠茶混合自制成袋泡茶）；D-無水葡萄糖標準品（中國藥品生物制品鑒定所，110833-201707）。

1.2 方法和結果

1.2.1 標準溶液的配制及標準曲線的繪制：精密稱取105℃干燥至恒重D-無水葡萄糖100mg置于100ml容量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得1.000mg/ml的葡萄糖溶液。精密移取此溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml置于 100ml容量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08mg/ml的葡萄糖標準品溶液。分別精密量取2.0ml各濃度的葡萄糖標準溶液至15ml具塞試管中，沿著各試管壁緩慢加入5.0ml冷的蒽酮-硫酸試劑，搖勻后蓋緊振搖，沸水浴中加熱10min，取出流水冷卻30min，另取2.0ml蒸餾水，加蒽酮-硫酸試劑，同上操作作為空白對照，在620nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 蒽酮-硫酸試劑的配制：稱取蒽酮0.2 g，緩慢加入100ml濃硫酸，邊加邊攪拌至黃色透明液，避光保存在棕色瓶中，現用現配，如有結晶析出，可稍加熱溶解。

1.2.3 樣品溶液的制備及測定：精密稱取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g置于250ml圓底燒瓶中，加入80%乙醇-水20ml回流60min，過濾，殘渣用80%乙醇-蒸餾水洗滌3次，收集殘渣揮干，用30ml蒸餾水每次回流1小時，回流2次，過濾，殘渣用蒸餾水洗滌3次，濾液置于250ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，再取20.0ml至100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，作為降糖袋泡茶總多糖樣品溶液。

精密量取樣品溶液2.0ml至15ml具塞試管中，照“1.2.1”項標準曲線繪制的方法操作，依法測定吸光度，采用標準曲線法計算樣品中多糖的含量。

1.2.4 檢測波長的選擇：精密移取標準葡萄糖溶液2.0ml至15ml具塞試管中，沿著各試管壁緩慢加入5.0ml冷的蒽酮-硫酸試劑，搖勻后蓋緊振搖，沸水浴中加熱10min，取出流水冷卻30min，同上操作作為空白對照，在400-800nm的波長范圍內掃描。另精密移取樣品溶液2.0ml，按相同方法顯色后在400-800nm的波長范圍內掃描。同時按相同方法配置不顯色的樣品溶液，在相同波長范圍內掃描，結果標準葡萄品溶液和樣品溶液經顯色后在波長620±1nm處均有最大吸收，未顯色的樣品溶液幾乎無吸收。因此，選擇620nm為降糖袋泡茶總多糖的測定波長。

1.2.5 標準曲線及線性范圍：分別精密量取2.0ml各濃度的葡萄糖標準溶液至15ml具塞試管中，按“1.2.1”項標準曲線繪制的方法繪制標準曲線。Y=14.234x-0.0044，相關系數為0.9991，葡萄糖在0.01-0.08mg/ml濃度范圍內線性關系良好。

1.2.6 精密度試驗：精密吸取葡萄糖對照品溶液2.0ml，按“1.2.1”項下方法，在620nm處測定吸光度，連續測定5次，并計算RSD。實驗結果見表1，RSD為0.11%，說明該方法精密度好。

表1 精密度試驗結果

1.2.7 重復性試驗：在同一樣品溶液中分別移取2.0ml，平行5份，按“1.2.1”項下方法，在620nm處測定吸光度，求RSD。實驗結果見表2，RSD為0.13%，說明該方法具有良好的重現性。

表2 重復性試驗結果

1.2.8 穩定性試驗：移取同一供試品溶液2.0ml，按“1.2.1”項下方法，分別在室溫下放置 30、60、90、120、150min 時，在 620nm處測定吸光度（n=5），并計算RSD。實驗結果見表3，RSD為0.58%，由此可見，溶液在顯色冷卻后150min內穩定性好。

表3 穩定性試驗結果

1.2.9 加標回收率試驗：精密稱取已知濃度為61.01mg/g的樣品粉末1.0g，共5份，分別放入250ml圓底燒瓶中，精密加入無水葡萄糖對照品10.1mg，按“1.2.3”項方法制備樣品溶液，然后按“1.2.1”項下方法測定吸光度，計算回收率以及RSD值。實驗結果見表4，回收率平均值為98.19%，RSD=3.30%。

表4 加標回收率試驗結果

1.2.10 樣品的測定：精密稱取降糖袋泡茶樣品粉末約1.0g，共5份，按“1.2.3”項方法制備樣品溶液和測定。實驗結果如表5，降糖袋泡茶中多糖的平均含量為6.08%。

表5 降糖袋泡茶中多糖含量測定結果

2 討論

2.1 樣品處理條件的選擇

2.1.1 樣品回流時間的確定：精密稱取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g三份置于250mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇-水20mL回流60min，過濾，殘渣用80%乙醇-蒸餾水洗滌3次，收集殘渣揮干。三份樣品用蒸餾水分別回流30min、60min和90min。回流完畢，用250ml容量瓶定容，分別取20ml再定容成100ml。然后按“1.2.1”項下方法，在620nm處測定吸光度值。結果見表6，顯示回流60min時，多糖提取基本完全。

表6 不同回流時間下樣品溶液的吸光度值

2.1.2 樣品回流溶劑量的確定：精密稱取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g三份置于250mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇-水20mL回流提取60min，過濾，殘渣用80%乙醇-蒸餾水洗滌3次，收集殘渣揮干。三份樣品分別加20、30、40ml的蒸餾水當溶劑，回流60min后，抽濾，用蒸餾水洗滌濾渣3次后，分別將溶液定容成 250ml，取 20.0ml再定容成 100ml，然后按“1.2.1”項下方法，在620nm處測定吸光度。實驗結果見表7，顯示提取溶劑量為30ml時多糖提取基本完全。

表7 不同溶劑量下樣品溶液的吸光度值

2.1.3 樣品回流提取次數的選擇：精密稱取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g三份置于250ml圓底燒瓶中，加入80%乙醇-水20ml回流60min，過濾，殘渣用80%乙醇-蒸餾水洗滌3次，收集殘渣揮干。殘渣分別用30ml蒸餾水每次回流60min，三份樣品分別回流1次、2次、3次。回流完抽濾，用蒸餾水洗滌濾渣后，用250ml容量瓶定容，取20.0ml再定容成100ml，然后按“1.2.1”項下方法，在620nm處測定吸光度。實驗結果見表8，顯示回流提取2次時多糖提取基本完全。

表8 不同提取次數下樣品溶液的吸光度值

2.2 測定條件的選擇

2.2.1 反應溫度的確定：精密移取對照品溶液2.0ml，加入蒽酮-硫酸試劑，按“1.2.1”項下方法，分別選擇在 40℃、60℃、80℃、90℃、100℃的水浴鍋中加熱10min，隨行作空白，然后在620nm處測定吸光度。實驗結果見圖1，當反應溫度為100℃時，測定的吸光度值最大，因此顯色反應最佳溫度為100℃。

2.2.2 反應時間的確定：精密吸取對照品溶液2.0ml，加入蒽酮-硫酸試劑，按“1.2.1”項下方法，在沸水浴中加熱，加熱時間分別為 5、8、10、15、20min，隨行作空白，然后在 620nm 處測定吸光度。由實驗結果圖2，當反應時間選擇10min時測得的吸光度值最大，因此顯色反應的時間確定為10min。

圖1 不同反應溫度測得的吸光度值

圖2 不同反應時間測吸光度值

3 討論

本文建立的蒽酮-硫酸法測定降糖袋泡茶總多糖含量方法準確、可靠，可用于該降糖袋泡茶總多糖的質量控制。