殼聚糖/納米銀制備抗菌紙及其抗菌效果研究

李志健 楊麗紅杜 飛 于之涵 李俊煒

（陜西科技大學輕工科學與工程學院，陜西省造紙技術及特種紙品開發重點實驗室，輕化工程國家級實驗教學示范中心，陜西西安，710021）

抗菌紙的研究是近年來抗菌材料應用的一個新領域，由于它與人們的工作、生活休戚相關，有很大的實用價值，引起了人們的普遍關注，因此發展十分迅猛，如醫療用紙、新生兒用紙等。單一的抗菌劑往往不能滿足抗菌紙的某種要求，抗菌劑的使用向著混合聯用的方向發展。

殼聚糖是天然多糖幾丁質的脫乙酰產物[1-2]，具有良好的生物相容性和生物降解性，且本身無毒無害，具有抗菌能力，被廣泛用于服裝、醫藥衛生、食品包裝等領域。由于殼聚糖本身的抗菌能力較弱，因此研究者們對殼聚糖進行物理或化學改性，或者引入外源抗菌因子與殼聚糖混合聯用來提高殼聚糖復合材料的抗菌性能[3-6]。Zhang等人[7]將納米TiO2粉末混入殼聚糖溶液中制成薄膜用于食品包裝，來延長食物的保鮮時間。Simin等人[8]將殼聚糖納米纖維與纖維素納米纖維復合后制成薄膜涂覆于紙幣上來賦予紙幣抗菌性能。

納米銀具有殺菌作用，滲透性強且無任何耐藥性[9-11]，近年來，銀也作為一種功能性材料發展很快。李爽等人[12]綜述了將納米銀負載于纖維上制備抗菌紙，納米銀作為光催化氧化的催化劑可以用作造紙廢水處理等工業用途。Kofi等人[13]采用一步火焰法將納米銀粒子噴涂于纖維材料上制備抗菌紙。但銀作為一種重金屬，大量的使用對生產者和使用者均有一定的危害，因此在達到相同抗菌能力的前提下，減少銀的使用成為研究的重點。

本實驗通過將納米銀和殼聚糖有效混合后使用，使紙張獲得協同的抗菌性能，既減少了納米銀的使用量，也改善了單一殼聚糖抗菌性能弱的問題。為了滿足抗菌劑在抗菌紙中應用的需求，對兩種抗菌劑最佳濃度和添加量進行了研究。

1 實 驗

1.1 實驗原料

闊葉木漿板，江蘇UPM公司；殼聚糖，脫乙酰度＞90%，上海展云化工有限公司；營養物質（蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏、瓊脂粉），北京奧博星生物技術有限責任公司；硝酸銀（AgNO3），分析純，天津市大茂化學試劑廠；檸檬酸鈉，分析純，天津市盛奧化學試劑有限公司；大腸桿菌原液，國家微生物菌種保藏中心。

1.2 實驗設備

槽式打漿機（TD8-23，咸陽通達輕工設備有限公司）；標準漿料疏解機（992304，瑞典L＆W）；紙樣抄取器（TD10-200，咸陽通達輕工設備有限公司）；手提式壓力蒸汽滅菌器（GMSX-280，北京市永光明醫療儀器有限公司）；微生物培養箱（DHP-9031，上海一恒科學儀器有限公司）；激光顯微拉曼成像光譜儀（DXRxi，賽默飛世爾科技（中國）分子光譜部）；環境掃描電子顯微鏡（Q45，美國FEI和EDAX）；電熱鼓風干燥箱（DHG-9053A，上海一恒科技有限公司）；電子天平（MC249，北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米銀抗菌劑的制備

將AgNO3白色晶體分別按0.05mmol/L、0.5mmol/L配成AgNO3溶液，將檸檬酸鈉白色粉末與去離子水按質量比1︰99配成質量分數為1%的檸檬酸鈉溶液。取100 mL硝酸銀溶液置于250 mL圓底燒瓶中，開啟電動攪拌器攪拌并打開冷凝回流裝置，油浴升溫并加熱，最終將溫度設定為120℃。待溶液開始沸騰后加入2 mL檸檬酸鈉溶液繼續加熱，回流1 h后停止反應，得到納米銀（溶膠）抗菌劑[14-15]。避光常溫下保存。

1.3.2 殼聚糖抗菌劑的制備

（1）漿內添加

稱取1 g聚乙烯醇（PVA）加入到20 mL去離子水中，加熱攪拌至溶化，然后稱取2 g殼聚糖加入到PVA溶液中，攪拌均勻，得到殼聚糖抗菌劑。PVA溶液具有一定的膠黏性，在漿內添加抗菌劑的抄紙過程中加入可以防止抗菌劑的流失。

（2）表面涂布

稱取2 g殼聚糖加入到500 mL質量分數約0.2%的稀醋酸溶液中，室溫下攪拌使其混合均勻。溶解7～8 h后配制成質量分數約為0.4%的殼聚糖溶液。向殼聚糖溶液中滴加質量分數為0.2%的氫氧化鈉溶液調節pH值為7.5，此時殼聚糖溶膠從溶液中析出，溶液由澄清透明變為白色乳濁液。取100 mL殼聚糖乳濁液進行抽濾，得到殼聚糖抗菌劑。

1.3.3 殼聚糖/納米銀混合抗菌劑的制備

（1）漿內添加

稱取1 g PVA加入到20 mL去離子水中，加熱攪拌至溶化，然后稱取2 g殼聚糖加入到PVA溶液中，攪拌均勻后滴加納米銀抗菌劑，繼續攪拌得到殼聚糖/納米銀混合抗菌劑。

（2）表面涂布

稱取2 g殼聚糖加入到500 mL質量分數約0.2%的稀醋酸溶液中，室溫下攪拌使其混合均勻。溶解7～8 h后配制成質量分數約為0.4%的殼聚糖溶液。向殼聚糖溶液中滴加質量分數為0.2%的氫氧化鈉溶液調節pH值為7.5，此時殼聚糖溶膠從溶液中析出，溶液由澄清透明變為白色乳濁液。取100 mL殼聚糖乳濁液進行抽濾，得到殼聚糖抗菌劑，然后滴加納米銀抗菌劑，攪拌均勻后得到殼聚糖/納米銀混合抗菌劑。

1.3.4 抗菌紙的制備

（1）漿內添加

設置漿料打漿度為50°SR，紙張定量為60 g/m2，制備不同抗菌劑添加量的抗菌紙。實驗室紙頁成型器的面積為0.0317 m2，抄片的絕干漿質量為2 g，將所得抗菌紙剪切成直徑為20 mm的小圓片備用。

控制紙張定量不變，分別抄造添加單一殼聚糖抗菌劑的抗菌紙、添加單一納米銀抗菌劑的抗菌紙、添加殼聚糖/納米銀混合抗菌劑的抗菌紙，添加抗菌劑的配比如表1和表2所示（所用納米銀抗菌劑為0.5 mmol/L）

（2）表面涂布

設置漿料打漿度50°SR，紙張定量為60 g/m2，抄造空白紙（不加抗菌劑）10張。將空白紙裁剪至直徑為20 mm的圓紙片備用，圓紙片的絕干漿質量為0.02 g；將圓紙片放置在平整的玻璃板上，用涂布棒進行涂布，待其晾干后，密封遮光保存，備用。

表1 漿內添加單一抗菌劑的配比

表2 漿內添加混合抗菌劑的配比

分別抄造涂布單一殼聚糖抗菌劑的抗菌紙、涂布單一納米銀抗菌劑的抗菌紙、涂布殼聚糖/納米銀混合抗菌劑的抗菌紙。添加抗菌劑的配比如表3和表4所示（所用納米銀抗菌劑為0.05 mmol/L）。

表3 表面涂布單一抗菌劑的配比

表4 表面涂布混合抗菌劑的配比

1.3.5 抗菌實驗

（1）制作生物培養基

稱取一定量的營養物質放入燒杯中，將燒杯放在萬用爐上加熱，用玻璃棒攪拌直至溶質溶解，用5 mol/L NaOH（約0.2 mL）調pH值至7.0，用去離子水定容至1 L，分裝入三個錐形瓶中，用棉塞塞住并用報紙包住瓶口，與所用的平板培養皿、鑷子、玻璃棒、接種環一起在121℃高壓滅菌20 min。滅菌后開始倒平板，冷卻至50℃左右，將培養基迅速倒入無菌平板培養皿中，每個培養皿倒入約2/3的培養基，蓋上培養皿蓋后，輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布，平放在操作臺上，待瓊脂凝固后即制得平板，操作過程均為無菌環境。培養基成分如表5所示。

表5 培養基成分

（2）接種大腸桿菌進行抗菌實驗

用滅菌后的接種環，將大腸桿菌均勻接種于凝固的培養基上，然后將抗菌紙放置于培養基表面，將培養基放置于微生物培養箱，在溫度30℃、濕度90%環境下培養48 h后觀察，并將抗菌實驗后所得抑菌環直徑從不同角度測量3次，取其平均值，進行分析。

1.3.6 抗菌紙抗菌機理的研究

（1）環境掃描電子顯微鏡（ESEM）分析

在溫度30℃、濕度90%的微生物培養箱中進行48 h抑菌環實驗，選取培養皿中距抑菌環最遠處的大腸桿菌和相同培養皿中抑菌環邊緣大腸桿菌，制作ESEM樣本。用接種針分別將所選大腸桿菌從培養基中取下直徑為1.5 mm的菌落，在200 μL的生理鹽水中稀釋，充分分散后，吸取1滴在鋁箔紙上，將鋁箔紙放入30℃烘箱內干燥后，用導電膠將其粘貼在載物片上進行觀察。

（2）激光顯微拉曼成像光譜分析

選取與ESEM制樣同組樣品的大腸桿菌進行制樣，用接種針分別將所選大腸桿菌從培養基中取下直徑為1.5 mm的菌落，放入200 μL生理鹽水中稀釋，離心15 min，吸取上清液后再次加水離心，重復3次，避免大腸桿菌懸液中培養基的干擾。振蕩均勻后，吸取1滴于鋁箔紙上，放入30℃烘箱內干燥，將其用雙面膠固定于載物片上進行觀察。

激光顯微拉曼成像光譜儀的測試條件：激光器的激發波長532 nm；激光功率水平10 mW。特征拉曼光譜圖數據[16-17]如表6所示。

表6 特征拉曼光譜圖數據

（3）抗菌性能檢測

采用抑菌環實驗[18-19]對所得抗菌紙進行抗菌性能檢測。

2 結果與討論

2.1 抗菌實驗結果分析

2.1.1 抗菌劑用量對抗菌紙抗菌性能的影響

選取表1和表3所示殼聚糖抗菌劑配比進行分析。

圖1為不同殼聚糖添加量抗菌紙的抗菌效果圖。從圖1可以看出，抗菌紙的抗菌性能與殼聚糖的添加量成正比，隨著殼聚糖添加量的增加，抑菌環直徑增大，抗菌紙的抗菌性能增強。圖2為殼聚糖添加量對抗菌紙抑菌環直徑的影響。從圖2可以看出，隨著殼聚糖添加量的增加，抑菌環直徑不斷增大，當殼聚糖添加量為7.5%時，抑菌環直徑變化不大，抗菌紙所體現出的抗菌性能變化趨于平緩，為了保證抗菌紙有良好的抗菌效果和抗菌穩定性，選取10.0%為殼聚糖最佳添加量。

2.1.2 抗菌劑添加方式對抗菌紙抗菌性能的影響

選取殼聚糖添加量10.0%和納米銀溶膠添加量0.54%時不同添加方式的樣本進行分析。

抗菌劑添加方式對抗菌紙抗菌性能的影響如圖3、圖4所示。從圖3可以看出，漿內添加與表面涂布兩種方式所得抗菌紙的抑菌環實驗均有抑菌環出現，而且抗菌紙遠處的大腸桿菌生長良好；從圖4可以看出，在抗菌劑添加量相對于絕干漿質量相同時，表面涂布所得抗菌紙抑菌環的直徑均大于漿內添加抗菌劑所得抗菌紙。混合添加時，其中漿內添加混合抗菌劑的抑菌環直徑為23.9 cm，表面涂布混合抗菌劑的抑菌環直徑為25.1 cm，表面涂布抑菌環的直徑相較于漿內添加增大4.8%。

2.2 抗菌劑對大腸桿菌的抗菌機理分析

2.2.1 抑菌環遠處大腸桿菌結果分析

圖5所示為ESEM的結果。由圖5可以看出，大腸桿菌呈橢圓形的枕頭狀，形狀飽滿，并且其尺寸大小均一，分布密集。

激光顯微拉曼成像光譜測試結果如圖6所示。從圖6(a)可以看出，大腸桿菌維持著完整的細胞結構，核膜結構完整。圖6(b)結果顯示，拉曼位移在858 cm－1的吸收為酪氨酸吸收峰，在1308 cm－1處的吸收為酰胺Ⅲ、β-回折、腺嘌呤吸收峰，在1442 cm－1處的吸收峰為脫氧核糖吸收峰，在1667 cm－1處的吸收為胸腺嘧啶，C＝＝O伸縮振動，酰胺Ⅰ吸收峰。拉曼成像結果表明，大腸桿菌的核膜結構完整。ESEM與激光顯微拉曼成像光譜測試結果均說明抑菌環遠處的大腸桿菌并未受到抗菌劑的影響。

圖1 不同殼聚糖添加量抗菌紙的抗菌效果圖

圖2 殼聚糖添加量對抗菌紙抑菌環直徑的影響

圖3 抗菌劑不同添加方式所得抗菌紙的抗菌效果

圖4 抗菌劑的添加方式對抗菌紙抑菌環直徑的影響

圖5 抑菌環遠處大腸桿菌的ESEM圖像

圖6 抑菌環遠處大腸桿菌拉曼光譜圖

2.2.2 抑菌環邊緣大腸桿菌結果分析

抑菌環邊緣大腸桿菌的ESEM圖像如圖7所示。從圖7可以看出，與圖5相比，其中部分細菌的形態已經發生了變化。出現了偏圓形和細長桿狀的大腸桿菌，大腸桿菌形態的大小不一，形狀皺癟，不飽滿，細菌分布的密集程度較低并且很多細菌已經出現粘連現象。

圖7 抑菌環邊緣大腸桿菌的ESEM圖像

激光顯微拉曼成像光譜儀測試結果如圖8所示。從圖8(a)可以看出，抑菌環邊緣大腸桿菌未顯示出完整的細胞結構，且有物質流出；圖8(b)為整個大腸桿菌拉曼光譜圖，其中代表細胞膜的位置未出峰，表明大腸桿菌的細胞膜已經破裂，此外還出現了新的特征峰；在541 cm－1處的吸收為二硫鍵的色氨酸吸收峰，并且二硫鍵有反式-扭曲反式構象；圖8(c)和圖8(d)表示細胞的流出物；圖8(d)所示在541 cm－1處的吸收為色氨酸吸收峰，在1442 cm－1處的吸收為脫氧核糖吸收峰，即代表大腸桿菌擬核結構破碎，說明在抑菌環邊緣的大腸桿菌核膜結構已經破裂，不能維持細胞原有狀態。

ESEM與激光顯微拉曼光譜結果均驗證了抑菌環邊緣大腸桿菌中部分細菌的形態已發生了變化。抗菌劑不僅阻礙大腸桿菌的生長，而且會使細菌的核膜結構受損，細菌不能維持正常的生長發育，從而死亡。

3 結論

將納米銀溶膠和殼聚糖混合后作為抗菌劑，并采用漿內添加和表面涂布兩種方法制備抗菌紙，分析殼聚糖與納米銀溶膠的添加量對抗菌紙抗菌性能的影響。

3.1 殼聚糖添加量與抗菌紙的抗菌性能成正比，隨著殼聚糖添加量的增加，抑菌環的直徑增大，抗菌紙的抗菌性能增加；殼聚糖添加到一定量時，繼續增大殼聚糖的添加量，抗菌性能變化趨于不變，因此殼聚糖最佳添加量為10.0%。

3.2 表面涂布抗菌劑所制得的抗菌紙抗菌性能均強于漿內添加抗菌劑的抗菌紙；當殼聚糖添加量為10.0%和納米銀溶膠添加量為0.54%時，表面涂布混合抗菌劑的抑菌環直徑可達到25.1 mm，相比于漿內添加混合抗菌劑，抑菌環直徑增大4.8%。

圖8 抑菌環邊緣大腸桿菌拉曼光譜圖

3.3 殼聚糖/納米銀的協同抗菌能力強于單一抗菌劑的抗菌能力，與添加單一抗菌劑所達到相同抗菌效果的前提下，可減少納米銀的添加量。